华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的功能分析

为了解肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)在华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)闭壳肌肌肉生长和发育过程中所起的负调控作用,对华贵栉孔扇贝的MSTN启动子序列进行了生物信息学分析。结果显示,MSTN启动子序列长1 358 bp,有4个转录起始位点。核心启动子区为–100～–51 bp。有1个TATA-box (–92～–86 bp)和2个Ebox等顺式作用元件;潜在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等;启动子区域无CpG岛。成功构建了6个MSTN启动子不同长度片段的荧光素酶表达载体,瞬时转染到293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,表明6个启动子片段均有转录活性,PGL-534的活性最高,其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102,最低的为PGL-995。–216～–364区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,–364～–825区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。     

杂色鲍HSP90基因启动子的功能分析

为探索启动子在热休克蛋白90表达调控中的作用,本研究在课题组已有杂色鲍HSP90基因cDNA的基础上,通过Genome walking、Tail-PCR和常规PCR等技术克隆获得该基因的5′调控区序列。在翻译起始位点(ATG)和第一外显子(长度94 bp)之间有一个809bp的内含子,第一外显子之前的5′调控区共2800 bp,从预测的转录起始位点(A)起,共2811 bp。在转录起始位点(A)上游–30 bp处存在TATA box。潜在的转录因子结合位点包括ATF、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalpha、NF-1、NF-κappa B、GATA-1、Sox-2等。CpG岛预测软件分析其含1个CpG岛,长度为131 bp。实验构建了8个启动子缺失片段的萤火虫荧光素酶表达载体,通过瞬时转染293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,确定杂色鲍HSP90基因核心启动子区位于–98~83 bp。在–624~–539 bp,Oct-1、C/EBPalpha、NF-1这3个转录因子都起到一定的抑制作用。     

一种免疫诱导型鲤启动子的克隆与功能分析

为发掘适用于基因工程抗病育种的鱼类启动子,通过实时荧光定量PCR实验对鲤Rab GTP酶(Ras-associated binding-GTPases 1a3,Rab1a3)基因的表达模式进行了分析,证实该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录水平较高,且免疫激活后转录显著增强,符合基因工程抗病育种所需的外源免疫基因转录模式。从鲤细菌人工染色体文库中,使用Rab1a3基因特异引物筛选获得包含该基因区域的文库克隆,测序获得该基因完整序列,以及上下游调控序列。通过生物信息学手段,预测到长度为1014 bp的鲤Rab1a3基因启动子序列,该启动子不具有典型的TATA盒或CpG岛特征,存在多个免疫相关转录因子结合位点。在草鱼肾组织细胞系内验证该启动子活性,结果显示,绿色荧光蛋白基因和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,证实该片段具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,双荧光素酶报告基因检测结果显示,该启动子活性在免疫刺激后增强至免疫刺激前的8.67倍。研究表明,鲤Rab1a3基因启动子有望被开发成为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

团头鲂PGPHα亚基基因5’端侧翼序列克隆及其表达载体的构建

首先运用PCR-末端加尾法克隆了团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体糖蛋白激素α亚基（Pituitary glycoprotein hormone α subunit,PGPH α）基因5’端侧翼序列;然后利用生物信息学理论对该序列进行了序列分析;最后在序列分析结果的基础上,构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示,克隆所得到的团头鲂PGPH α亚基基因5’端侧翼序列长1399bp;其序列中包含潜在的TATA盒、GC盒,以及ERE、TRE、CRE、PGBE等对PGPH α亚基基因转录调控起重要作用的转录因子结合位点;启动子区域位于-40-10bp处。利用PCR方法扩增得到了全长1439bp以及1120bp、532bp、173bp均包含转录起始位点下游40bp序列的缺失片段,并将其连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂PGPH α亚基基因5’端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。     

团头鲂促性腺激素GtHⅡβ 亚基基因5′端启动子区克隆及表达载体构建

利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)促性腺激素Ⅱβ(GtHⅡβ)亚基基因5′端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示:克隆得到的GtHⅡβ亚基基因5′端侧翼序列长度为1354bp,其中包括TATA盒、ERE、ARE、PRE、GRE、LHX3、SF-1、Sp1、Pit-1、NF-Y和AP1等可能对GtHⅡβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点;转录起始位点位于-40～10bp。进一步利用PCR方法扩增得到了811bp(-771～+40bp)、601bp(-561～+40bp)、386bp(-346～+40bp)、239bp(-199～+40bp)和98bp(-58～+40bp)的5个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtHⅡβ亚基基因5′端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础依据。     

东北七鳃鳗NF-κB基因启动子的构建及活性

核转录因子NF-kB(Nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-kB基因启动子的活性报告基因，进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制，我们根据此前克隆得到的东北七鳃鳗(Lethenteron morii)NF-kB基因cds序列，以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗(Lampetra japonica)同源基因 5’上游启动子特征序列为模板设计引物，克隆获得了东北七鳃鳗NF-kB启动子序列，该序列全长3169 bp，提交至NCBI Genbank获得登录号MN368861。经AliBaba2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点，并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1207-1402 bp处存在CG含量大于50%，长196 bp的CpG岛。利用双酶切技术构建了pGL3-NF-kB-pro重组质粒，并将其转染至人胚肾细胞系（Human embryonal kidney, HEK293T）和鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）中。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示该片段序列在哺乳动物细胞系和鱼类细胞系中均具有启动子活性，同时在HEK293T中经过Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）的配体LPS刺激后启动子活性显著上升。本研究成功构建了东北七鳃鳗NF-kB启动子报告基因，并在不同细胞系中证实了其活性。LPS刺激后的检测结果揭示东北七鳃鳗NF-kB参与了TLR信号通路的免疫应答。东北七鳃鳗NF-kB报告基因的构建为探究原始脊椎动物免疫系统信号传导机制奠定了基础。     

虹鳟免疫诱导型基因Cathelicidin2启动子功能分析

本研究通过实时荧光定量PCR实验对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Cathelicidin2(Cath2)基因的转录模式进行了分析。结果显示,该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录,在细菌和病毒感染后,转录水平均显著升高。对基因上游调控序列进行启动子和转录因子结合位点预测,发现该启动子具有真核生物典型的TATA盒和CAAT盒结构,基因上游直至第一内含子区域内,密集存在多个免疫相关转录因子结合位点,其中,2个核因子κB(Nuclear factor kappa B,NFκB)预测结合位点均位于核心启动子正链区域。在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾组织细胞系内,绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,表明其具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)模拟的细菌感染和聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid,Poly I:C)模拟的病毒感染。双荧光素酶报告基因检测显示,启动子活性在与NFκB转录因子表达时,增强至4.39倍,证明Cath2基因受NFκB通路调控。研究表明,虹鳟Cath2基因能够在多种免疫刺激诱导下表达,其启动子可以应用为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时,避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列克隆与分析

应用PCR和Genome Walking技术克隆获得长度为168 bp的草鱼（ Ctenopharyngodon idellus）α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列和2063 bp的5＇侧翼序列。将草鱼α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列与已知几种鱼类α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列比对,相似度为68%~86%。将草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列进行生物信息学分析,确定了其转录起始区域及转录起始位点（ TSS）;在TSS上游30 bp处有1个TATA-box,-58 bp处有CCAAT-box;在5＇侧翼序列中还发现有GATA-1、OCT-1、GR、HNF-3、AP1和SP1等转录因子结合位点。草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列的克隆,为进一步研究不同食性鱼类α-淀粉酶基因侧翼序列的差异、鱼类α-淀粉酶基因的表达、功能及调控机理奠定基础。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了Activin两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了Activin βA和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb;在预测的Activin βB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在Activin βA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子MyoD、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在Activin βA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆Activin βA和βB表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

大口黑鲈POU1F1启动子区域SNPs对生长的影响

采用基因组步移技术克隆了大口黑鲈垂体特异性转录因子POU1F1启动子序列,该序列全长1 629 bp,预测存在4个八聚体转录因子1(Oct-1)结合位点和TATA框等基本转录元件,1个Homeobox转录因子结合位点和2个cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合位点。采用直接测序法研究发现,大口黑鲈POU1F1启动子序列的-18和-183两个位点存在SNPs,该两个突变位点只检测到A、B两种单倍型。对养殖群体进行不同单倍型的基因频率和生长关联分析,结果表明,单倍型A的等位基因频率为0.246,单倍型B的等位基因频率为0.754;群体关联分析表明,基因型为AA型和AB型的个体在体质量、体长、全长、体高和体宽等方面明显高于BB型个体,但基因型为AB型和AA型的个体之间在体质量方面没有明显差异。该研究结果为下一步进行分子标记辅助选择提供了基础。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

吉富尼罗罗非鱼Ikaros基因5''调控区的克隆、序列分析及抗无乳链球菌相关SNP位点筛选

为获得尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗链球菌病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究通过染色体步移法克隆了尼罗罗非鱼Ikaros基因5′调控区序列,长度为4178 bp,并使用生物信息学软件对Ikaros基因的启动子和转录调控元件进行预测和分析。利用PCR产物直接测序法从亲本(P0)尼罗罗非鱼Ikaros基因5′调控区中筛查到5个SNPs,分别为SNP1(g.562,GA)、SNP2(g.217,GT)、SNP3(g.–53,CT)、SNP4(g.–220,TC)和SNP5(g.–579,TC)。利用Snapshot技术对子一代(F1)尼罗罗非鱼易感群体和抗病群体进行相应SNPs的基因分型,分析两个群体遗传多样性参数,结果显示多态信息含量(polymorphism information content,PIC)值在0.0872~0.3747之间,表明Ikaros基因5′调控区中所有SNPs的多态性均较低。Ikaros基因5′调控区SNPs与抗链球菌病性状关联分析结果表明,SNP2、SNP3、SNP4和SNP5的基因型频率和等位基因频率在易感群体和抗病群体中存在显著差异(P0.05)。连锁不平衡分析结果显示Ikaros基因5′调控区SNPs可形成1个单倍块和5种单倍型,其中GGCTT单倍型与抗病性显著相关(P0.05),GGTCT和GTCCC单倍型与易感性显著相关(P0.05)。此外,还发现SNP2和SNP5处于完全连锁状态(r~2=1,LOD=57.25,D′=1),可作为罗非鱼抗链球菌病遗传育种的标签SNP。综上所述,在Ikaros基因5?调控区筛选到4个抗链球菌病相关SNPs和1个单倍型(GGCTT),均可作为尼罗罗非鱼分子育种的候选分子标记。     

食蚊鱼CYP19a基因的克隆与序列分析

硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。     

拟穴青蟹Cactus基因的cDNA克隆、序列及生物学功能

为获取拟穴青蟹Cactus基因cDNA全长、分析基本生物学信息,并初步探索其在病原物刺激下的免疫反应,实验采用RACE技术获得了拟穴青蟹Cactus(SpCactus)基因的cDNA全长序列,其cDNA全长为2035 bp,开放阅读框(ORF)1311 bp,编码436个氨基酸,分子量为46.01 ku。对蛋白理化性质进行预测发现,SpCactus为亲水性蛋白,等电点pI为4.91。经预测,SpCactus与其他物种的IκB蛋白具有相似的功能结构域。同源性比对结果显示,SpCactus与凡纳滨对虾和中国明对虾的Cactus蛋白同源性均高达62%,相似度为73%。系统进化树分析显示,SpCactus与甲壳动物聚为一支,与无脊椎动物聚为一大支。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现,SpCactus基因在拟穴青蟹不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次为心脏、眼柄、血液和鳃,肝胰腺中的表达量最低。LPS和金黄色葡萄球菌刺激均能显著诱导SpCactus基因的表达。本实验成功扩增了SpCactus基因全长,并进行了生物信息学分析、理化性质预测,初步探讨了其生物学功能,为进一步研究其在免疫反应中的生物学功能提供参考依据。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的克隆、表达模式及启动子活性

泛素-蛋白酶体系统作为重要的蛋白质修饰途径,参与多个生物学过程,其中泛素结合酶E2作为关键酶可以决定泛素化对靶蛋白的影响。为了探究泛素结合酶E2在半滑舌鳎雌性性腺发育中的作用,本研究克隆了半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的开放阅读框ORF,检测了该基因在不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式;构建了其启动子报告基因载体(pGL3-Cs-UBE2D4)并进行了启动子活性分析。Cs-UBE2D4开放阅读框为360 bp,编码119个氨基酸,含有保守的泛素结合酶E2结构域。荧光定量PCR结果显示,Cs-UBE2D4在雌鱼的各组织中广泛表达,其中在卵巢和肝脏中表达量较高,而在雄鱼中几乎检测不到表达;在卵巢各发育阶段中,该基因的表达量从90日龄开始上调,6月龄达到峰值,之后开始下调,在1.5龄时表达量最低,在3龄时表达量有所回升,其中6月龄表达量为90日龄表达量的1.97倍。双荧光素酶活性检测结果显示,Cs-UBE2D4启动子具有较强的转录活性。本实验将为进一步开展Cs-UBE2D4基因对半滑舌鳎卵巢发育和性别调控相关机制的研究提供理论依据。