黄鳝性腺差异表达基因的筛选和克隆

运用ACP—DDRT—PCR技术筛选和克隆了黄鳝不同发育时期性腺组织的差异表达基因。结果显示：利用2个随机ACP引物筛选到2个表达差异显著的基因，并对这2条差异表达片段进行克隆、测序分析，获得这2个基因的部分cDNA序列，长度分别为408bp和421hp。同源性分析结果显示其中一个基因与黄鲈卵巢cDNA文库中的一个基因（Gene BankNo．G0657149．1）高度同源；而另一个基因无同源性序列，视为新报道的基因。进一步半定量RT—PCR检测，结果显示：这两个基因在黄鳝卵巢和间期性腺中的表达差异显著，因此推测其在黄鳝性腺发育以及性逆转过程中起着重要作用。     

黄鳝性腺差异表达基因的筛选和克隆

运用ACP—DDRT—PCR技术筛选和克隆了黄鳝不同发育时期性腺组织的差异表达基因。结果显示：利用2个随机ACP引物筛选到2个表达差异显著的基因，并对这2条差异表达片段进行克隆、测序分析，获得这2个基因的部分cDNA序列，长度分别为408bp和421bp。同源性分析结果显示其中一个基因与黄鲈卵巢cDNA文库中的一个基因（GeneBankNo．G0657149．1）高度同源；而另一个基因无同源性序列，视为新报道的基因。进一步半定量RT—PCR检测，结果显示：这两个基因在黄鳝卵巢和间期性腺中的表达差异显著，因此推测其在黄鳝性腺发育以及性逆转过程中起着重要作用。     

氨氮对白斑狗鱼成鱼的急性毒性研究

采用常规生物急性毒性实验法，研究了在pH7．85、水温8℃条件下，氨氮对白斑狗鱼成鱼的急性毒性。结果表明，自斑狗鱼对氨氮的耐受力不强，氨氮对白斑狗鱼成鱼的24、48、72、96h的半数致死浓度分别为45．85、35．26、27．24、24．92mg/L，安全浓度为2．492mg/L；非离子氨对白斑狗鱼的24、48、72、96h的半数致死浓度分别为0．613、0．471、0．364mg/L、0．333mg/L，安全浓度为0．033mg/L。     

LR 型微囊藻毒素对鲢鱼PEPCK基因表达的影响

在前期经LR 型微囊藻毒素（MC-LR）处理后建立鲢鱼肝脏组织抑制差减杂交文库的基础上,利用RACE 方法克隆了经MC-LR 处理后差异表达明显的鲢鱼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK 基因cDNA 全长,并对其进行了序列分析,然后通过半定量分析了经MC-LR 投与1、5、10 h鲢鱼肝脏组织PEPCK 表达水平。结果显示：鲢鱼PEPCK 基因cDNA 全长2 605 bp,包括101 bp 的5'' 端非翻译区、564 bp 的3'' 端非翻译区、1911 bp 的开放阅读框,编码636 个氨基酸。将鲢鱼PEPCK 基因cDNA 核酸及氨基酸序列与GenBank 中已发表的其他几种鱼类的相应序列进行比对,表明鲢鱼PEPCK 与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97%和99%;其次为斑马鱼,同源性均达到90%以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77%和84%,说明鱼类PEPCK 在长期的进化过程中具有很高的保守性。鲢鱼PEPCK 具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP 三磷酸链结合的激酶1 和激酶2 基序。另外,鲢鱼投予MC-LR 后,肝脏组织PEPCK 经过1、5、10 h 的表达量均有显著升高,说明鲢鱼投予MC-LR 1 h内该基因即被诱导表达,且在10 h内皆维持较高的表达水平。这与微囊藻毒素作用有关,推测与微囊藻毒素解毒过程相关。     

黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析

应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝(Monopterus albus)Ⅳ期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以间期性腺为试验方,Ⅳ期卵巢为驱动方;反向差减杂交以Ⅳ期卵巢为试验方,间期性腺为驱动方.将获得的差减cDNA片段连接质粒载体,然后转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子.经PCR扩增鉴定插入片段范嗣为200～2000 bp.随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析,得到90个有效基因片段,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对.进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR,对文库质量进行验证.结果表明,所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的.黄鳝性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础.     

LR 型微囊藻毒素对鲢鱼PEPCK基因表达的影响

在前期经LR型微囊藻毒素(MC-LR)处理后建立鲢鱼肝脏组织抑制差减杂交文库的基础上,利用RACE方法克隆了经MC-LR处理后差异表达明显的鲢鱼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因cDNA全长,并对其进行了序列分析,然后通过半定量分析了经MC-LR投与1、5、10 h鲢鱼肝脏组织PEPCK表达水平.结果显示:鲢鱼PEPCK基因cDNA全长2 605 bp,包括101 bp的5 '端非翻译区、564 bp的3 '端非翻译区、1 911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸.将鲢鱼PEPCK基因cDNA核酸及氨基酸序列与GenBank中已发表的其他几种鱼类的相应序列进行比对,表明鲢鱼PEPCK与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97％和99％;其次为斑马鱼,同源性均达到90％以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77％和84％,说明鱼类PEPCK在长期的进化过程中具有很高的保守性.鲢鱼PEPCK具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序.另外,鲢鱼投予MC-LR后,肝脏组织PEPCK经过1、5、10 h的表达量均有显著升高,说明鲢鱼投予MC-LR 1 h内该基因即被诱导表达,且在10 h内皆维持较高的表达水平.这与微囊藻毒素作用有关,推测与微囊藻毒素解毒过程相关.     

饥饿对白斑狗鱼耗氧率、代谢率及主要生化指标的影响

在不同温度下[(3±0.5) ℃,(8±0.5) ℃和(13±0.5) ℃)]对白斑狗鱼的呼吸耗氧率、代谢率及主要生化指标(肝糖元,乳酸,酸、碱性磷酸酶)进行120 h的饥饿试验.试验结果表明:在水温为(3±0.5) ℃、(8±0.5) ℃和(13±0.5) ℃下,白斑狗鱼的耗氧率与饥饿时间呈负相关,分别由(0.005 1±0.001 7) mg/(g·h)、(0.016±0.001 9)mg/(g·h)和(0.025±0.005 4) mg/(g·h)下降至(0.001 1±0.000 35)mg/(g·h)、(0.009 8±0.001 2) mg/(g·h)和(0.015±0.003 2) mg/(g·h).代谢率随着饥饿程度的加深而降低,分别由(5.23±0.34) mg O2/(kg·h)、(16.05±23.89) mg O2/(kg·h)和(25.39±37.28) mg O2/(kg·h)下降至(1.08±0.052) mg O2/(kg·h)、(7.48±14.77) mg O2/(kg·h)和(14.99±21.94) mg O2/(kg·h).肝糖元随着饥饿程度的加深而减少,分别由(67.70±6.66) mg/g、(59.69±5.75) mg/g和(41.83±3.72) mg/g减少至(54.14±5.12) mg/g、(38.77±3.38) mg/g和(19.18±1.14) mg/g;肝组织中乳酸含量随饥饿程度的加深而增加,分别从(0.36±0.004) 1 mmol/g prot、(0.25±0.002 9) mmol/g prot和(0.15±0.003 4) mmol/g prot增加至(3.16±0.089) mmol/g prot、(0.87±0.008 4) mmol/g prot和(0.48±0.028) mmol/g prot;随着饥饿时间的推移,肝胰脏中的酸、碱性磷酸酶活力也出现不同程度的增强,在(3±0.5) ℃下,分别增加了217.36 U/g prot和157.85 U/g prot;在(8±0.5) ℃下,分别增加了27.67 U/g prot和34.43 U/g prot;在(13±0.5) ℃下,分别增加了98.62 U/g prot和10.95 U/g prot.     

二氧化碳麻醉对白斑狗鱼的影响

在不同水温(8℃和13℃)试验条件下,观察了白斑狗鱼经二氧化碳麻醉处理后的麻醉行为,测定了其主要生化指标的变化.试验表明:(1)白斑狗鱼的麻醉行为是一个渐变的过程,可分为不被麻醉(O)、轻度麻醉(A1)、中度麻醉(A2)、深度麻醉(A3、A4).(2)麻醉效果随着水温的升高而增强.从8℃水温到13℃水温时,麻醉用时由17 min 21 s缩短至14 min 15 s,复苏用时由8min 29 s缩短至3min 14 s.(3)在不同温度下经过麻醉处理后,白斑狗鱼的肝糖原减少;乳酸增加,酸、碱磷酸酶的活性都有所增加.     

温度对白斑狗鱼耗氧率、窒息点及主要生化指标的影响

在不同温度下,测定了平均体重为(597.2±96.3)g的白斑狗鱼(Esox lucius)的呼吸耗氧率、窒息点及主要生化指标。结果显示:在水温为3℃、8℃、13℃和18℃下,白斑狗鱼的耗氧率随着温度的升高而显著上升(P<0.05)。3℃时耗氧率最低;为(0.0047±0.000017)mg/g.h,18℃时耗氧率最高;为(0.029±0.0011)mg/g.h。当水温在13℃时,白斑狗鱼的昼夜平均耗氧率在(0.020±0.0031)mg/g.h,15:00耗氧率最低,11:00耗氧率出现最高值。Q10值的变化显示白斑狗鱼的耗氧率对温度具有敏感性,13～18℃时,Q10最小,此温度为白斑狗鱼的较适生长温度。在高温下(18℃),白斑狗鱼呼吸急促,呼吸频率达到(68.50±3.58)次/min;在低温下(3℃),白斑狗鱼呼吸缓慢,呼吸频率下降到(29.00±4.31)次/min。白斑狗鱼的窒息点随着水温的升高而增大,水温为13℃,其窒息点最高为1.68 mg/L,水温为3℃时,其窒息点最低为0.82 mg/L。随着水温的不断上升,白斑狗鱼的肝糖元含量、肝胰脏中的乳酸含量显著减少(P<0.05)。肝糖元含量由(67.70±6.66)mg/g降至(41.83±3.72)mg/g。乳酸含量由(0.36±0.0041)mmol/gprot降至(0.15±0.0034)mmol/gprot。肝胰脏中的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的酶活力随着水温的升高而小幅缓慢下降,分别由(21.51±0.69)U/gprot和(22.34±0.43)U/gprot降至(19.04±0.62)U/gprot和(18.10±0.41)U/gprot。     

氨氮对白斑狗鱼成鱼的急性毒性研究

采用常规生物急性毒性实验法，研究了在pH7．85、水温8℃条件下，氨氮对白斑狗鱼成鱼的急性毒性。结果表明，白斑狗鱼对氨氮的耐受力不强，氨氮对白斑狗鱼成鱼的24、48、72、96h的半数致死浓度分别为45．85、35．26、27．24、24．92mg／L，安全浓度为2．492mg／L；非离子氨对白斑狗鱼的24、48、72、96h的半数致死浓度分别为0．613、0．471、0．364ms／L、0．333mg／L，安全浓度为O．033mg／L。