草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA提取方法的研究

基于传统的酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿一步提取法,比较分析多种优化操作步骤,摸索出一种高质量提取体质量为80~150 g草鱼肠系膜脂肪组织总RNA的改良方法。试验结果显示,相较于肝脏、脾脏、肠道等脏器组织,草鱼肠系膜脂肪组织RNA丰度低,且极易在样品前处理阶段出现顽固性降解问题。探索发现,将取样量增至约30 mg,可提升RNA产量以满足常规试验需求。针对降解难题,改良常规的样品前处理技术流程,采用鲜样液氮速冻,冻样直接放入TRIzol试剂中裂解,并即刻进行长时间机械匀浆,时长约3 min等核心操作步骤,可显著降低脂肪组织样品RNA的降解。Agilent生物分析仪检测结果显示,改良方法提取的草鱼肠系膜脂肪组织RNA完整度高,关键RIN值为8.7~9.0。研究推测,长时间机械匀浆所形成的持续剪切冲击力或许有助于TRIzol试剂中的异硫氰酸胍等成分突破油滴阻碍而有效抑制内源性RNA酶。本方法提取的草鱼脂肪组织总RNA质量可满足高通量转录组测序要求。     

大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

在动物体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是以酶原形式存在于溶酶体中,能水解多种蛋白,是调控动物生长发育的重要候选功能基因。为开发与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究对大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因上的SNP位点进行筛选。经PCR扩增和测序分析,从该基因中筛选到1个SNP位点(命名为C+598G),该位点属于错义突变位点,编码的甘氨酸突变成为精氨酸。采用Sna Pshot方法对C+598G位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行检测,并分析其在群体中的遗传多样性。结果显示,C+598G位点在养殖群体中存在CC、GC和GG3种基因型,其频率分别是40.6%、47.3%和12.1%,C和G等位基因频率分别是64.2%和35.8%;该位点在群体中的观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为0.473和0.354,符合哈代-温伯格平衡定律。进一步分析不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性,结果表明,3种基因型个体的体质量、全长、体高、尾柄长和尾柄高性状平均值从小到大依次为GG型、GC型和CC型,其中GG型个体在体质量上显著小于CC型个体(P<0.05)。本研究获得的C+598G标记与大口黑鲈生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种研究中的生长标记。     

驯食配合饲料的大口黑鲈3个选育世代的遗传多样性分析

为了检测驯食配合饲料的大口黑鲈(Micropterus salmoides)3个选育世代群体遗传多样性水平变化,利用微卫星标记技术对驯食配合饲料大口黑鲈选育基础群体(Sp0)和第二、三和四代选育群体(Sp2、Sp3和Sp4)共240尾样品进行检测。结果显示,18个微卫星位点共获得44个等位基因。Sp0、Sp2、Sp3和Sp4的平均观测杂合度(H_o)分别为0.4895、0.4802、0.4579和0.4206,平均期望杂合度(H_e)分别为0.4615、0.4454、0.4621和0.3916,平均多态信息含量(PIC)分别为0.3791、0.3659、0.3764和0.3257。4个群体间的配对比较群体间遗传分化指数(F_(st))值在0.01612～0.16162之间、遗传距离(D_a)在0.0249～0.1434之间。遗传变异来源(AMOVA)分析显示,只有8.38%的变异来自于群体间,其余遗传变异均来自于个体间。研究表明,经连续多代选育之后,易驯食配合饲料的快长大口黑鲈选育群体具有中度遗传多样性,具备选育潜力,可继续进行选育。     

大口黑鲈遗传连锁图谱的构建

采用AFLP技术结合＂拟测交＂策略,以大口黑鲈Micropterus salmoides选育家系作为亲本进行单对杂交产生的F1代家系为作图群体,初步构建了大口黑鲈雌、雄性遗传连锁图谱。结果表明：用64对AFLP引物组合对父母本和106个子代个体进行遗传分析,共得到398个分离标记。母本分离标记有189个,其中172个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记有209个,其中181个符合1∶1孟德尔分离标记。雌性框架图包括75个遗传标记,分布在21个连锁群中,有6个三联体,6个连锁对,标记间平均间隔为18.22cM,图谱总长度为983.8 cM;雄性框架图包括82个遗传标记,分布在22个连锁群中,有7个三联体,5个连锁对,标记间平均间隔为19.22 cM,图谱总长度为1153.2 cM。雌、雄性基因组估算长度分别为1 399.85和1 582.72,图谱的总覆盖率分别达到70.28%和72.86%。     

转红色荧光蛋白基因唐鱼与非转基因唐鱼肌肉营养成分的分析和比较

对含有外源基因的转红色荧光蛋白基因唐龟(简称:转基因唐鱼)和同胞家系中不含有外源基因唐鱼(简称:非转基因唐鱼)肌肉中的一般营养成分、游离氨基酸和脂肪酸的组成和含量进行分析和比较.结果表明:转基因唐鱼肌肉水分、粗蛋白含量粗灰分含量高于非转基因唐鱼,粗脂肪含量低于非转基因唐鱼,但差异均不显著(P>0.05);转基因唐鱼和非...     

大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种及其杂交子代的遗传分析

用18对微卫星引物对大口黑鲈北方亚种(Micropterus salmoides salmoides,N)、佛罗里达亚种(M.salmoides floridanus,F)及其正交子代(N♀×F♂)和反交子代(F♀×N♂)进行遗传多样性和遗传结构分析。结果表明,18对引物扩增出的等位基因数为2~8个,平均等位基因数为5.0。检测到6对(Jzl48、Jzl68、Jzl84、MiSaTPW76、Msal21、Mdo6和Mdo7)亚种间特异性引物,其中有2对引物(Jzl48和Mdo7)可以用来鉴别大口黑鲈北方亚种、佛罗里达亚种和其杂交子代。平均有效等位基因数、平均期望杂合度和平均多态信息含量均为杂交组合F♀×N♂最高,分别为3.199 7,0.638 9和0.570 6,平均观测杂合度为杂交组合N♀×F♂最高(0.848 8)。对亲代与杂交子代间的遗传分化分析表明,正反交子代均与北方亚种的遗传分化最小(0.092和0.119 6)。基于Nei’s遗传距离构建的UPGMA系统进化树显示正交子代N♀×F♂与母本N聚为一支,反交子代F♀×N♂与父本N聚为一支。     

皇竹草和人工配合饲料营养成分分析及其对2月龄草鱼的增重效果

[目的]测定皇竹草和人工配合饲料的营养成分含量,探讨用其饲喂2月龄草鱼的增重效果。[方法]根据不同的成分测定要求,测定皇竹草和人工配合饲料的主要营养成分含量。用皇竹草和人工配合饲料饲喂2月龄草鱼,研究其对2月龄草鱼的增重效果。[结果]冬季鲜样水分含量为76．04％,粗蛋白14．61％,粗脂肪2．34％,粗灰分10．43％,粗纤维19．加％,碳水化合物53．42％;人工配合饲料水分含量为6．8％,粗蛋白37．66％,粗脂肪3．22％,粗灰分9．55％,粗纤维3．65％,碳水化合物45．92％。鲜皇竹草粗纤维的含量明显高于普通人工饲料,而粗蛋白的含量则相反,其他成分差异不明显。利用二者对2月龄草鱼进行投喂,结果发现全程投喂皇竹草的草鱼组的体重及其他可量生长性状都明显低于人工配合饲料组。{结论12月龄草鱼以皇竹草作为主要营养物质的增重效果不如人工配合饲料。     

转红色荧光蛋白基因唐鱼肌肉中抗生素标记基因(NPTⅡ)检测和表达量分析

为了获得有特色的观赏鱼,本实验室在2003年将含有海葵红色荧光蛋白基因的表达载体(同时含有标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ))转入唐鱼(Tanichthys albonubes)的受精卯,获得转红色荧光蛋白基因唐鱼,对其外源标记基因NPTⅡ的表达产物和存在时间进行分析,为评价转基因鱼的生物安全提供依据.本实验对转基因唐鱼和非转基因唐鱼肌肉中抗生素标记基因(NPTⅡ)进行PCR检测和NPTⅡ表达产物的免疫检测试剂条检测,结果显示,转基因唐鱼检测到NPTⅡ基因和表达产物,而非转基因唐鱼中均没检测到该基因和表达产物存在.同时在唐鱼死亡后(水温20～25℃),应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对死亡0 (鲜活肌肉)、24、48、72、96、120和144 h组的转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白的含量进行定量检测,结果表明,转基因唐鱼鲜活肌肉中NPTⅡ蛋白在肌肉中的含量为9.12 ng/g,随着转基因唐鱼死亡时间增加肌肉中NPTⅡ蛋白含量逐渐减少,死亡96 h组转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白已经接近为0.结果表明,转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白在白然环境中容易降解,推测其对环境安全隐患相对较低.     

草鱼羧肽酶A1基因(CPA1)部分片段的单核苷酸多态性(SNP)多态性及其与生长性状的关联分析

羧肽酶A (EC 3.4.16)是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基的消化酶.在草鱼生长相关的功能基因上研究单核苷酸多态性(SNP)与生长的相关性可为草鱼的分子辅助育种提供依据.本研究根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库的羧肽酶A1基因(CPA1)重叠群的2个Contig扩增该基因的序列片段,采用直接测序法,经过序列比对,共筛到2个颠换SNP位点:C+412A和A36C,分别位于CPA 1基因外显子5的34bp和内含子3的36 bp处,前者为错义突变.然后用一个群体的296尾草鱼对这2个位点用SnaPshot的方法进行检测和分型,统计基因型频率:A36C位点的AA基因型占26.7％,AC基因型占52.0％,CC基因型占21.3％.C+412A位点的AA基因型占15.5％,AC基因型占40.5％,CC基因型占43.9％.利用一般线性模型分析2个SNP位点与草鱼体质量、体长等重要生长性状的关系.关联分析结果显示,C+36A位点不同基因型在体质量、眼间距均值上存在显著差异(P＜0.05).并且AA基因型和CC基因型在体质量、体长、体宽和眼间距上存在显著差异(P＜0.05).AA基因型各项指标均值显著高于CC基因型.C+412A位点在体质量等生长性状上差异不显著(P＞0.05),该位点和生长不相关,但是CC基因型和AC基因型在体重和肛前距上差异显著(P＜0.05),该位点CC基因型的6个生长性状均值都高于AA基因型.由两个位点组成的5种双倍型在体质量上存在显著差异(P＜0.05).双倍型D3和D5在体质量上存在差异显著(P＜0.05).双倍型D3和D8在体质量、体宽、体长、体长/头长等生长性状上都存在显著差异(P＜0.05).D3的各项指标均值最高,D8的各项指标均值最低.本研究结果显示,可以考虑将草鱼CPA1基因作为候选基因,用于草鱼的分子辅助育种.     

大口黑鲈LPL基因SNPs及其与适应人工配合饲料能力的相关性研究

大口黑鲈(Micropterus salmoides)为肉食性经济鱼类,喜食活饵或冰鲜鱼,养殖过程中大量投喂冰鲜鱼或大量使用鱼粉作为饲料,增加了养殖成本,且容易对环境造成污染。为了降低养殖成本、保护环境,使其适合喂食蛋白含量适中的人工配合饲料,提高大口黑鲈对人工配合饲料的适应能力,选育适合食人工配合饲料的大口黑鲈是解决这个问题的有效途径。有研究表明,饲料中的脂肪水平对大口黑鲈的脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)的表达水平有显著的影响。本研究以大口黑鲈LPL基因作为候选基因,根据已知的c DNA序列设计引物,PCR扩增测序得到大口黑鲈LPL type1基因组序列6 170 bp,包括10个外显子和9个内含子,LPL type2基因组序列4 419 bp,包括5个外显子和4个内含子。利用直接测序法,在LPL type1基因中筛选到11个SNP位点,在LPL type2中筛选到6个SNP位点。将1个喂食冰鲜鱼的成鱼养殖群体中的192尾鱼和1个幼鱼驯食养殖群体中的142尾鱼,分别用筛选得到的SNP位点进行基因分型,结果发现,在LPL type1基因中筛选到的11个SNP位点紧密连锁,用T+156A表示;在LPL type2基因中筛选到的6个SNP位点也紧密连锁,用C-224T表示,而LPL type1和LPL type1的SNP位点间不存在连锁关系,且SNP位点所构成的基因型在两个群体中的分布频率相似。将上述SNP位点所构成的基因型与两个大口黑鲈群体的体重、全长和体高等生长性状进行相关性分析,结果表明,LPL基因中的SNP位点虽然与成鱼的生长性状不存在显著的相关性,但在LPL type1基因T+156A SNP位点的AA基因型与TT基因型与幼鱼在驯食后的饱食与空腹状态存在显著的相关性,且AA基因型在幼鱼体质量和全长两个性状上存在显著的优势(P0.05),说明T+156A SNP位点与大口黑鲈适应人工配合饲料的能力有显著相关。LPL type1基因可作为提高大口黑鲈成活率、选育适合食人工配合饲料大口黑鲈的潜在候选基因。本研究为推进大口黑鲈适应人工配合饲料新品种的选育工作提供了可靠的研究数据,也为其他肉食性鱼类的驯食选育工作提供了借签和参考。