利用微卫星标记对文蛤4个壳色花纹品系的遗传分析

利用9个微卫星位点对文蛤红壳(RS)、黑斑(BS)、细纹(TC)、暗纹(DF)4个壳色花纹品系共120个个体进行遗传差异分析。结果共检测到105个等位基因,每个位点平均观察等位基因数为11.7个,其中WG07位点等位基因数最多(21个),WG11位点最少(7个)。每个品系均具有特异等位基因类型,不同品系中相同微卫星位点的等位基因分布规律不同。4个文蛤品系的观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量变异范围分别为0.110～1.000、0.486～0.867、0.433～0.834,均属高度多态性位点。Hardy-Weinberg平衡的卡方检测发现,大多数位点偏离平衡状态;聚类分析表明,4个品系间存在较明显的遗传差异,TC品系与其它品系的遗传距离最大,DF品系和RS品系的遗传距离相对较小。     

浙江和广西两种文蛤的分子鉴定及形态特征分析

以文蛤如东群体(RD)和北海群体(BH)为对照群,利用线粒体COⅠ基因序列分析技术对苍南文蛤(CN)和北海白壳文蛤(BW)进行了分子鉴定。结果表明,苍南文蛤和斧文蛤的碱基组成非常相似,通过文蛤属贝类基因序列同源性比对和分子系统聚类分析发现,苍南文蛤CN1、CN2与斧文蛤的同源性分别达到100.0%、99.2%,在依据遗传距离构建的系统进化树上,2个苍南文蛤也与斧文蛤单独聚为一支,据此将苍南文蛤确定为斧文蛤,此结果将斧文蛤的分布区域向北扩展到了浙江南部沿海,修正了现有文献中记载的仅在我国南海诸省分布的说法;而白壳文蛤与其它6种文蛤的基因序列同源性都不高(79.6%~85.3%),在系统进化树上单独分出一支,明显是独立于这些文蛤之外的新种。斧文蛤、白壳文蛤与文蛤群体COⅠ基因的遗传多样性分析显示,文蛤BH群体的变异位点数、单倍型数和核苷酸多样性指数均最大,斧文蛤其次,而白壳文蛤10条基因序列完全相同,未发生任何核苷酸位点变异,说明其遗传多样性很低。应用方差分析和Tukey多重比较,分析了斧文蛤、白壳文蛤与文蛤群体的形态差异,发现斧文蛤的壳长明显大于壳高,且SMW/TW、IW/TW 2个参数与文蛤、白壳文蛤群体差异显著(P<0.05);而白壳文蛤的壳宽指数大、壳型相对膨胀,SW/SL和SW/SH值均最大,与文蛤和斧文蛤群体差异显著(P<0.05)。本研究结果可为文蛤属贝类种间鉴别、种质资源保护及系统进化研究提供基础资料。     

泥蚶Smad1/5基因cDNA全全长克隆及时空表达特征分析

为了研究Smad1/5基因在泥蚶生长、发育过程中的调控作用，本文利用SMART RACE方法克隆得到泥蚶Smad1/5基因（Tg-Smad1/5）的cDNA全长序列，该序列全长2 424 bp，开放阅读框有1 386 bp，编码462个氨基酸。Tg-Smad1/5蛋白与合浦珠母贝Smad5、太平洋牡蛎Smad5和大西洋舟螺Smad1的同源性分别达到了92.3%，91.2%和80.4%，与脊椎动物的同源性都在70%以上；该蛋白包含MH1和MH2区两个较为保守的结构域，此结构与高等动物Smad1和Smad5蛋白极为相似，表明该基因在物种进化过程中比较保守。利用qRT-PCR技术，研究了Smad1/5基因在泥蚶6个组织和9个发育时期中的表达情况，结果显示，Tg-Smad1/5基因在泥蚶成贝6个组织中均有表达，而在斧足中的表达量最高，极显著地高于其他组织；在各发育时期中，Tg-Smad1/5表达量随发育进程呈逐渐升高的趋势，在眼点幼虫期达到最高，极显著高于其他时期，而在变态至稚贝时，表达量又极显著地下降。研究结果表明，Tg-Smad1/5具有类似于高等动物的分子结构，并在泥蚶不同组织、不同发育时期表达有所差异，这为进一步研究该基因在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。     

海洋经济贝类遗传图谱的相关研究进展

遗传连锁图谱的构建,是遗传学研究的一个重要领域,它为人们进一步认识生物基因组组成、克隆染色体的基因及定位重要经济性状的主效基因奠定了基础.遗传图谱的建立为基因定位,特别是一些重要经济性状和数量性状位点(QTL)定位,以至最终为克隆这些基因提供基础.     

斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化

采用电镜和荧光显微镜技术,对斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化进行了系统研究。电镜观察表明,斧文蛤精子为鞭毛型,全长45.2~47.7 μm,由头部、中段和尾部三部分组成。头部呈稍弯曲的狭茧形,长约2.5 μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈圆锥形,内部中轴处有亚顶体腔;细胞核为长锥形,有核前窝和核后窝。中段由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个近球形的线粒体呈单层梅花状排列;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,远端中心粒延伸出尾部的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,内部的轴丝呈典型的“9+2”结构,外周有波浪状质膜包被。用荧光显微镜观察了斧文蛤受精及早期卵裂过程的细胞学变化,结果发现，斧文蛤成熟未受精卵呈圆球形,核相处于第一次成熟分裂中期;在水温27~28 ℃条件下受精,受精后6 min,精子入卵并膨胀成球形;受精后12~15 min、20~25 min受精卵排出第一、第二极体;30 min左右,精、卵核膨胀形成雄、雌原核;35 min,两性原核在卵子中央发生染色体联合;40~45 min,受精卵进行第一次卵裂,形成2个大小不等的分裂球;55~60 min,第二次卵裂结束,形成1大3小4个卵裂球,核相变化与第一次卵裂基本相同;75~80 min,第三次卵裂完成,自此次起开始进行螺旋分裂。另外,在斧文蛤受精过程中发现了约1%的多精入卵现象,其对成熟分裂和早期卵裂过程影响很大,常造成成熟分裂紊乱和第一次卵裂染色体分离异常。     

缢蛏受精和早期卵裂过程的细胞学变化观察

采用普通光镜、荧光显微镜和石蜡切片技术,对缢蛏受精和早期卵裂过程中的精子入卵、减数分裂、雌雄原核形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学事件进行了显微观察。结果表明,缢蛏成熟未受精卵多呈圆球形或卵圆形,少数呈梨形,卵径为82～88μm,核相处于第一次成熟分裂中期;精子为典型的原生型,全长55～58μm,头部呈保龄球形,顶体前端的顶体杆呈特别细长的花丝状;在水温21～22℃、盐度10的条件下进行人工授精,精、卵混合后,精子迅速附着于卵子表面,启动卵子发育;受精后4～6 min,精子的头部已进入卵内并明显膨胀,卵子外形变圆,卵外附着的精子量明显减少;在受精后12～15 min、20～25 min,受精卵先后排出第一极体、第二极体,完成两次成熟分裂;第二次成熟分裂结束以后,精、卵核体积迅速膨胀,雄原核的膨胀早于雌原核,核膜重建,在受精后约30 min形成雌、雄原核;雌、雄原核均向卵子中央移动,雄原核旁边的精子星光清晰可见,随后二者在卵子中央以染色体联合的方式结合,联合核的染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40 min左右,受精卵进行第一次卵裂,染色体在纺锤丝的牵引下向两极移动,结果形成2个大小不等的卵裂球;受精后45～50 min,卵子进行第二次卵裂,核相变化与第一次卵裂相同,在与第一次卵裂垂直的纵轴方向上发生不等全裂,最终形成3小1大4个卵裂球;受精后60～70 min,胚胎进行第三次卵裂,仍为不等全裂,但自此次卵裂起已开始进行螺旋分裂。此外,对实验中发现的缢蛏极少量多精入卵、多极分离等异常细胞学现象进行了分析,并探讨了海洋贝类卵子阻止多精入卵发生的机制。     

泥蚶生长性状相关AFLP分子标记的筛选

以浙江乐清泥蚶养殖群体为育种基础群,经过2代连续选育获得了泥蚶快速生长品系,生长对比试验发现其在壳长、壳高、壳宽、总体质量等性状上都表现出了显著的生长优势。为了研究快速生长品系的遗传结构并筛查生长性状相关的分子标记,利用AFLP标记技术对泥蚶快速生长品系和对照组群体的基因组DNA进行了PCR扩增和电泳检测。采用40对多态性丰富的引物组合在64个个体中共扩增出2180条带谱,扩增位点总多态性比例达85.6%。从Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数反映的遗传多样性来看,选育品系的遗传多样性略高于对照组群体。群体遗传分化系数GST(0.0224)和基因流Nm(22.2811)数据显示,两群体间遗传变异很小,存在明显的基因流动。通过比对AFLP指纹图谱的位点差异,在2180条扩增带中共筛选出了7个显著性差异位点,其中2个位点只在选育品系中出现,2个位点在选育品系中出现的频率极显著高于对照组(P<0.01),另有3个位点在对照组中出现频率显著高于选育品系(P<0.05)。据此初步确定这些位点为与生长性状相关的候选标记。     

3种壳色花纹文蛤常规营养成分分析与评价

本试验对红壳、黑斑、白壳3种壳色花纹文蛤的常规营养成分进行了检测,旨在分析和评价不同壳色花纹文蛤在营养价值上的差异。解剖取软体部,采用国家标准方法测定组织中水分、粗蛋白质、粗脂肪含量以及氨基酸、脂肪酸组成。结果表明:文蛤软体部鲜样中水分含量为81.15%~81.89%,粗蛋白质含量为9.23%~9.71%,粗脂肪含量为1.31%~1.91%,其上述常规营养成分的含量在3种文蛤中均不存在显著差异(P>0.10)。采用酸水解法,在3种文蛤软体部干样中均检测到17种氨基酸,其中总氨基酸(TAA)含量为42.95%~48.45%,鲜味氨基酸(DAA)含量为17.44%~20.88%,且DAA含量红壳文蛤有高于白壳文蛤的趋势(P<0.10);3种文蛤软体部中第一限制性氨基酸均为缬氨酸。在3种文蛤软体部干样中检测到22~23种脂肪酸,其中多不饱和脂肪酸(PUFA)含量为36.07%~39.55%,C20∶5(n-3)(EPA)含量为11.37%~12.87%,C22∶6(n-3)(DHA)含量为9.82%~12.44%,其中EPA含量红壳文蛤有高于白壳文蛤的趋势(P<0.10),DHA含量红壳文蛤有高于白壳文蛤和黑斑文蛤的趋势(P<0.10)。由此可见,本试验检测的3种文蛤营养价值均较高,其中以红壳文蛤最高,且其鲜味度最优。     

文蛤SRBI基因变异与红壳色性状的关联性

为了解文蛤体内类胡萝卜素代谢相关基因清道夫受体B类I(Mm-SRBI)与红壳色形成的关联性,采用直接测序法对基因编码区进行SNP筛查和关联分析,并用免疫荧光、蛋白免疫印迹分析了Mm-SRBI蛋白在红、白壳色文蛤外套膜中的表达差异。结果显示,在Mm-SRBI基因的编码区筛选到15个SNP位点,位于保守序列上的4个突变位点c.647C/T、 c.723A/G、 c.818C/T、 c.1037A/G与红、白壳色存在显著关联,其中c.723A/G位点为非同义突变(异亮氨酸突变为缬氨酸),且4个位点在遗传上存在强连锁性;蛋白免疫印迹与免疫荧光结果表明,Mm-SRBI在红壳中的蛋白表达量显著高于白壳文蛤,主要表达部位为外套膜边缘膜的纤毛处。研究表明,Mm-SRBI基因的高表达与变异可能导致文蛤对类胡萝卜素的代谢产生差异,从而在生长发育过程中导致红壳色的形成。     

泥蚶奉化种群与韩国种群形态特征和遗传结构的差异分析

利用形态学标记和微卫星标记技术,研究了泥蚶奉化种群和韩国种群的壳形态和遗传结构的差异,为泥蚶良种培育提供科学依据。对同批2龄泥蚶奉化种群和韩国种群的壳长(SL)、壳高(SH)、壳宽(SW)、壳顶宽(SRW)、总质量(TW)、软体部质量(IW)进行测量,以各性状的相对比值作为形态分析指标,考察了SH/SL、SW/SL、SRW/SL、IW/TW 4个指标的差异。方差分析和Tukey多重比较结果表明,韩国种群的SW/SL、SRW/SL 2个形态指标均极显著高于奉化种群(P0.01),表明韩国种群的壳型比奉化种群更加鼓胀;IW/TW极显著高于奉化种群,表明韩国种群的软体部含量高,即出肉率高。选用6个高度多态的微卫星标记分析了泥蚶韩国种群和奉化种群的遗传差异,结果 6个微卫星位点在2个种群中共检测出64个等位基因,其中5个位点的PIC值0.5,表现出高度多态性;遗传多样性分析表明,奉化种群和韩国种群在等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等遗传参数上差异很小,遗传分化系数Fst为0.022;但2个群体的遗传距离为0.136 7,在TMP18、ETG7等位点的等位基因数和期望杂合度等参数上存在显著差异,表明2个种群的遗传结构已经发生了一定程度的变异。