坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析

6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用.实验以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得坛紫菜的3条TPS基因序列:PhTPS1,PhTPS2-1和PhTPS2-2.序列分析结果表明,PhTPS1(收录号:KM580358)序列全长3 557 bp,包含一个3 462 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 153个氨基酸,分子量为124.2 ku,等电点为6.73,属于TPS Ⅰ亚家族;PhTPS2-1(收录号:KM519457)序列全长4 264 bp,包含一个4 044 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 374个氨基酸,分子量为145.2 ku,等电点为5.96;PhTPS2-2(收录号:KM519458)序列全长3 733 bp,包含一个3 324 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 107个氨基酸,分子量为120.2 ku,等电点为5.42.PhTPS2-1和PhTPS2-2属于TPSⅡ亚家族.基因表达水平的定量分析结果表明高温胁迫条件下,3条PhTPS基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调,再上调的趋势;而PhTPS1和PhTPS2-1基因在中低水平的失水条件下,基因表达水平均没有发生显著变化,只在高水平失水胁迫下显著上调,PhTPS2-2基因在中高水平失水条件下,表达水平显著上调.说明PhTPS基因可能只在高度失水胁迫下发挥应激调节作用.     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

坛紫菜谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及表达特征

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是植物活性氧(ROS)清除酶促系统的重要成员之一,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料采用RACE技术克隆获得了一条坛紫菜的GPX全长基因序列,命名为PhGPX(Gen Bank收录号:JX673908)。该基因序列全长1027 bp,包含555 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含184个氨基酸,分子量为19.9 k D,等电点为8.76。多序列比对和系统进化树分析结果表明Ph GPX属于植物GPX基因家族成员。基因表达水平的q PCR分析结果表明Ph GPX基因在坛紫菜叶状体和丝状体世代中的表达水平没有显著差异;高温胁迫不同时间水平下,Ph GPX基因的表达水平呈现为先上调后下调的趋势;不同失水胁迫条件下,Ph GPX基因的表达不受低水平的失水胁迫影响,但可被高水平(40%)的失水胁迫所抑制,且在复水30 min后仍然无法恢复失水胁迫前的水平。由此推测坛紫菜体内的GPX也可能存在多种家族成员,不同的逆境胁迫条件、甚至不同的逆境胁迫水平可能需要不同家族成员的GPX参与ROS的清除和防御。     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

坛紫菜核糖体蛋白S15a基因的克隆及表达分析

坛紫菜栽培中经常遭遇高温胁迫危害而产生烂菜现象,为研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,分离并克隆高温胁迫应答的相关基因,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系Z-61叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得一条在高温胁迫条件下表达水平显著降低的基因片段,通过5'-RACE技术获得了它的全长,命名为Phrps 15a(GenBank登录号:JN991055.1).该基因序列全长676 bp,包含一个390 bp的开放阅读框编码130个氨基酸的核糖体S15a蛋白(PhRPS 15a),蛋白分子式为C664H1066N188O180S7,由3条螺旋、7个片层及8个环状连接组成,与多个物种的RPS15a蛋白具有较高的序列一致性(78％～80％).系统进化分析表明,动物、高等植物、绿藻和坛紫菜PhRPS15a蛋白均享有独立的进化分支,但坛紫菜PhRPS 15a蛋白与团藻和莱茵衣藻的亲缘关系更近.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps 15α基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫条件下,Phrps15a基因的表达水平极显著下调.     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

坛紫菜转录因子NhbZIP1克隆和功能验证

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一,阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因,但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp,编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中,BRLZ是bZIP家族的保守结构域,含有一个α卷曲螺旋结构(121~171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示,高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型,且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明,NhbZIP1激活下游抗逆基因表达,在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制,为耐高温新品种选育提供了基础信息。     

广东紫菜Hsp70基因eDNA克隆与表达分析

为探索广东紫菜(Pyropia guangdongensis)叶状体Hsp70基因在温度刺激下机体耐温相关分子机制，为广东紫菜的栽培生产提供技术参考，本研究利用RACE技术获得了广东紫菜Hsp70基因(PgHsp70)全长序列，并在此基础上采用实时荧光定量PCR技术，研究广东紫菜叶状体分别在不同温度(22℃、27℃和31℃)条件下处理0、1/6、1/2、1、6、12、24和36 h后PgHsp70基因的差异表达。结果显示，PgHsp70基因序列长2004 bp，包含一个1866 bp的开放阅读框，可编码621个氨基酸，预测分子量为67.7 kDa，理论等电点为4.87。基因表达水平定量分析表明，温度对PgHsp70基因表达水平有显著影响，PgHsp70基因在不同温度的表达水平变化趋势基本一致，均呈现先上调后下降的趋势，且均于1 h表达量到达最高水平，其中，在31℃ 1 h表达量最高，为未经高温处理组的11倍，说明PgHsp70基因在应答高温胁迫中发挥着重要的作用。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及其表达特征分析

本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列，采用cDNA末端快速扩增技术克隆获得了脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT)。该基因cDNA全长为1855 bp，其中，开放阅读框为1407 bp，5?端非编码区为39 bp，3?端非编码区为409 bp，共编码468个氨基酸，预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa，理论等电点为4.90。同源性分析显示，脊尾白虾SHMT基因与甲壳类动物真宽水蚤(Eurytemora affinis)同源性最高，为96%。荧光定量分析结果显示，SHMT基因在脊尾白虾眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢中均有表达，其中，卵巢表达量最高，心脏次之。不同浓度Cd2+胁迫结果显示，其在低浓度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L) Cd2+胁迫中的表达模式基本一致，呈先升高后下降再升高再下降的趋势；而在高浓度(0.0278 mmol/L) Cd2+胁迫中，该基因表达量很低，甚至不表达，说明高浓度Cd2+胁迫可以抑制该基因的表达，具体机制有待进一步研究。     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据。结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1108、1638和1881条差异性表达基因。GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等。KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3 h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9 h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路。荧光定量PCR(q RT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境。     

凡纳滨对虾核自身抗原精子蛋白基因克隆及其表达

利用cDNA末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)核自身抗原精子蛋白(NASP)基因,NASP基因c DNA全长2258 bp,其中包括92 bp 5′端非编码区,147 bp 3′端非编码区及2019 bp开放阅读区,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 k D。该序列已提交至Gen Bank,序列号为KT274811。在NCBI上进行序列比对后发现,其与斑节对虾(Penaeus monodon)NASP序列相似性最高,为90%。采用荧光定量PCR方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中NASP m RNA相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量高于肝胰腺中的表达量,且在Ⅱ期表达量最高,Ⅲ期表达量最低。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其他物种间的遗传距离。实验结果为进一步研究该基因在凡纳滨对虾卵巢发育中的作用提供了依据。     

高光胁迫下坛紫菜定量PCR内参基因的筛选

为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBC、TUB、18S、EF2、ACT和GAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、Ge Norm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;ge Norm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBC和EF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。     

凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子 基因(Lv-SOCS)的克隆及特征分析

为了探讨凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子(SOCS)在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,本实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾的SOCS基因(Lv-SOCS,GenBank注册号:KJ000426),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-SOCS的ORF区1 191 bp,编码397个氨基酸,预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个SH2结构域和1个SOCS-box结构域,组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肠道和肝胰腺中表达。在WSSV感染后中晚期(6~48 hpi),Lv-SOCS可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,上述结果为进一步研究Lv-SOCS基因在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。