坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析

6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用.实验以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得坛紫菜的3条TPS基因序列:PhTPS1,PhTPS2-1和PhTPS2-2.序列分析结果表明,PhTPS1(收录号:KM580358)序列全长3 557 bp,包含一个3 462 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 153个氨基酸,分子量为124.2 ku,等电点为6.73,属于TPS Ⅰ亚家族;PhTPS2-1(收录号:KM519457)序列全长4 264 bp,包含一个4 044 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 374个氨基酸,分子量为145.2 ku,等电点为5.96;PhTPS2-2(收录号:KM519458)序列全长3 733 bp,包含一个3 324 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 107个氨基酸,分子量为120.2 ku,等电点为5.42.PhTPS2-1和PhTPS2-2属于TPSⅡ亚家族.基因表达水平的定量分析结果表明高温胁迫条件下,3条PhTPS基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调,再上调的趋势;而PhTPS1和PhTPS2-1基因在中低水平的失水条件下,基因表达水平均没有发生显著变化,只在高水平失水胁迫下显著上调,PhTPS2-2基因在中高水平失水条件下,表达水平显著上调.说明PhTPS基因可能只在高度失水胁迫下发挥应激调节作用.     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

坛紫菜丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及表达特征

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在植物应答逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料,采用普通PCR技术克隆得到2条坛紫菜的SHMT全长基因序列,分别命名为PhSHMT-1(GenBank收录号:MF687405)和PhSHMT-2(GenBank收录号:MF687406)。其中,PhSHMT-1序列全长1710 bp,包含一个1491 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含497个氨基酸,分子量为121.443 kDa,等电点为4.93;PhSHMT-2序列全长1957 bp,包含一个1395 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含465个氨基酸,分子量为113.969 k Da,等电点为4.95。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhSHMT-1和PhSHMT-2基因属于SHMT基因家族。qRT-PCR定量分析结果表明,高温胁迫条件下,2条PhSHMT基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调再上调的趋势,这说明SHMT基因可能在坛紫菜应答高温胁迫过程中发挥作用。     

坛紫菜核糖体蛋白S15a基因的克隆及表达分析

坛紫菜栽培中经常遭遇高温胁迫危害而产生烂菜现象,为研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,分离并克隆高温胁迫应答的相关基因,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系Z-61叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得一条在高温胁迫条件下表达水平显著降低的基因片段,通过5'-RACE技术获得了它的全长,命名为Phrps 15a(GenBank登录号:JN991055.1).该基因序列全长676 bp,包含一个390 bp的开放阅读框编码130个氨基酸的核糖体S15a蛋白(PhRPS 15a),蛋白分子式为C664H1066N188O180S7,由3条螺旋、7个片层及8个环状连接组成,与多个物种的RPS15a蛋白具有较高的序列一致性(78％～80％).系统进化分析表明,动物、高等植物、绿藻和坛紫菜PhRPS15a蛋白均享有独立的进化分支,但坛紫菜PhRPS 15a蛋白与团藻和莱茵衣藻的亲缘关系更近.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps 15α基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫条件下,Phrps15a基因的表达水平极显著下调.     

坛紫菜转录因子NhbZIP1克隆和功能验证

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一,阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因,但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp,编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中,BRLZ是bZIP家族的保守结构域,含有一个α卷曲螺旋结构(121~171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示,高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型,且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明,NhbZIP1激活下游抗逆基因表达,在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制,为耐高温新品种选育提供了基础信息。     

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据。结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1108、1638和1881条差异性表达基因。GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等。KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3 h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9 h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路。荧光定量PCR(q RT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境。     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

坛紫菜响应高光胁迫的分子机制

坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）生活于中高潮区，退潮后会遭受到周期性的强光胁迫，但高潮复水后坛紫菜叶状体可以快速恢复正常生长，表明坛紫菜具有极强的耐高光能力。然而，其耐高光机制尚不明确。为此，本研究挑选了两个耐高光能力具有显著差异的坛紫菜新品系作为研究对象（绿色品系：9-IV；桔色品系：WO141-3），测定了高光胁迫下两个品系藻体的光合速率、抗氧化酶活性等生理指标，构建了两个品系的差异转录表达谱，并结合荧光定量分析技术获得了调控坛紫菜耐高光的关键通路和基因。具体结果如下：在高光胁迫下，两种坛紫菜品系叶状体的丙二醛含量均显著上升，光系统部分基因表达量显著降低，藻体光合能力显著下降。进一步分析发现，WO141-3品系在高光处理1 h具有更强的高光抗性，而9-IV品系在处理4 h后具有更强的高光抗性，造成这种差异的主要原因是：高光胁迫处理1 h时，WO141-3品系具有更高的活性氧清除能力、更强的非光化学淬灭能力以及更低的色素含量和捕光蛋白基因表达量；而在高光胁迫处理4 h时，9-IV品系的活性氧清除能力和非光化学淬灭能力更强，色素含量和捕光蛋白基因表达量都更低。以上结果说明，坛紫菜藻体可以通过激活非光化学淬灭机制和抗氧化系统，以及降低色素含量和捕光蛋白基因表达应对高光胁迫，避免遭受过度光损伤和氧化损伤。本研究结果为阐明紫菜的耐高光机理奠定了理论基础。     

抗生素处理对坛紫菜叶状体生长和藻际微生物的影响

设计了氨苄青霉素、硫酸庆大霉素和卡那霉素3种抗生素的不同组合处理坛紫菜叶状体,旨在筛选出坛紫菜叶状体藻际微生物的最优去除方法;同时,探究紫菜叶状体生长与微生物群落变化之间的关系。结果显示,低浓度(10μg/mL)的硫酸庆大霉素或高浓度(800μg/mL)的卡那霉素处理,对坛紫菜叶状体生长均具一定的抑制作用,而不同浓度的氨苄青霉素处理均促进了叶状体生长。500μg/mL的氨苄青霉素、500μg/mL的硫酸庆大霉素与300μg/mL的卡那霉素3种抗生素混合处理叶状体24 h,不会抑制叶状体的生长;同时,对藻际微生物有较强的抑制性。不同的坛紫菜品系,不同的叶状体日龄和培养密度,以及在不同的海水盐度和不同浓度的营养盐中培养,抗生素处理组圆盘体的生长均比对照组快。通过比较抗生素处理组与对照组分离的菌株后发现,抗生素处理组有两株菌落形态和菌株形态与对照组显著不同的特有菌株。研究表明,在坛紫菜叶状体的生长过程中,某些对叶状体生长起阻碍作用的细菌如果大量繁殖,会抑制对叶状体生长有益的细菌繁殖,当用抗生素抑制了阻碍生长的细菌,就会使益生菌成为优势菌,促进叶状体的生长,益生菌对上述抗生素的处理不太敏感,但由于培养条件的改变,抗生素对阻碍生长的细菌的抑制作用会减弱,使得它们大量繁殖,从而抑制叶状体的生长。     

福鼎敏灶湾2012年坛紫菜烂菜原因初探

对2012年10月福鼎敏灶湾海区坛紫菜烂菜情况进行采样、调查和原因分析。结果显示坛紫菜烂菜症状主要为叶状体梢部颜色变红,部分藻体颜色变淡、发白,烂化甚至脱落。烂菜原因主要有：（1）高温小潮期,海面风力小、浪静,由波浪形成的海水垂直流动交换弱,藻体与海水中的二氧化碳和营养盐等微交换也随之变弱,从而导致坛紫菜细胞生理机能下降;（2）坛紫菜养殖过密,海水中含氮量偏低,使得坛紫菜生长受限制;（3）南侧近岸海域水流不畅、流速较缓,悬浮物等污染物质积聚于该海域,易粘附于坛紫菜叶状体,影响坛紫菜的生长。为此作者提出防范建议旨在为今后福建省坛紫菜健康养殖可持续发展提供参考意见。     

高光胁迫下坛紫菜定量PCR内参基因的筛选

为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBC、TUB、18S、EF2、ACT和GAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、Ge Norm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;ge Norm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBC和EF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。     

Biomarkers of bone development and oxidative stress in gilthead sea bream larvae fed microdiets with several levels of polar lipids and α‐tocopherol

Although dietary marine phospholipids are able to improve culture performance of marine fish larvae in a further extend than soybean lecithin, both types of phospholipids (PL) markedly increase oxidative risk. The inclusion of a fat‐soluble antioxidant such as the vitamin E α‐tocopherol could allow a better control of oxidative stress. The objective of this study was to determine the combined effect of graded levels of α‐tocopherol with different levels and sources of krill phospholipids (KPL) and soybean lecithin (SBL) on growth, survival, resistance to stress, oxidative status, bone metabolism‐related genes expression and biochemical composition of sea bream larvae. Sea bream larvae were completely weaned at 16 dph and fed for 30 days seven microdiets with three different levels of PL (0, 40 and 80 g kg^?1 diet) and two of α‐tocopherol 1500 and 3000 mg kg^?1 diet. Sea bream larvae fed diets without PL supplementation showed the lowest survival, growth and stress resistance, whereas increase in PL, particularly KPL, markedly promoted larval survival and growth. However, feeding SBL markedly increased TBARs and GPX gene expression increasing the peroxidation risk in the larvae. Besides, KPL inclusion improved incorporation of n‐3 HUFA and, particularly, EPA into larval tissues, these fatty acids being positively correlated with the expression of BMP‐4, RUNX 2, ALP, OC and OP genes and to bone mineralization for a given larval size class. The increase in dietary α‐tocopherol tends to improve growth in relation to the n‐3 HUFA levels in the diet, denoting the protective role of this vitamin against oxidation. Indeed, dietary α‐tocopherol decreased the oxidative stress in the larvae as denoted by the reduction in larval TBARs contents and gene expression of SOD and CAT, but not GPX. Thus, increase in dietary α‐tocopherol effectively prevented the formation of free radicals from HUFA, particularly EPA, but did not affect the incidence of bone anomalies or the expression of genes related to osteogenetic processes.     

Dietary nano‐selenium enhances antioxidant capacity and hypoxia tolerance of grass carp Ctenopharyngodon idella fed with high‐fat diet

To evaluate the effects of dietary nano‐selenium (Nano‐Se) on antioxidant capacity and hypoxia tolerance of grass carp fed with high‐fat diet, experimental fishes were fed Nano‐Se supplemented diets at doses of 0 (Control), 0.3, 0.6, 0.9 and 1.2 mg/kg for 10 weeks. After feeding trial, a part of the fishes were exposed to hypoxia stress. Results showed that the survival ratio of grass carp significantly increased in 0.6 and 0.9 mg/kg Nano‐Se group, and the content of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) significantly decreased in 0.6–1.2 mg/kg Nano‐Se groups compared with the control group. In addition, dietary Nano‐Se significantly enhanced glutathione peroxidase (GPX) activity and reduced the malondialdehyde (MDA) content in fishes fed diets with 0.3 and 0.6 mg/kg Nano‐Se. Dietary Nano‐Se significantly elevated mRNA expression of GPX1 and catalase (CAT) by promoting the mRNA expression of NF‐E2‐related nuclear factor 2 (Nrf2) in the hepatopancreas. After hypoxia stress, the GPX and superoxide dismutase (SOD) activities were significantly enhanced, and the MDA content and mortality rate consequently decreased in fishes fed diets with 0.3 and 0.6 mg/kg Nano‐Se. In summary, these results suggested that optimal Nano‐Se in diet enhanced the antioxidant capacity and hypoxia tolerance of grass carp.