图像辅助流式细胞仪在中华绒螯蟹血细胞分析中的应用

[目的]探讨图像辅助流式细胞仪在中华绒螯蟹血细胞分类中的应用。[方法]建立了一种基于新型图像辅助流式细胞仪的自动化方法,并与显微镜观察对比,分析其在中华绒螯蟹血细胞分类方面的效果。[结果]2种方法均显示中华绒螯蟹血细胞可根据胞内颗粒差异分为4类。利用该研究建立的新方法测量河蟹血淋巴中无颗粒、小颗粒、中颗粒和大颗粒细胞的比例分别为(54.33±3.38)%、(27.63±2.10)%、(5.43±0.35)%和(12.51±3.38)%。由于显微镜参考的是可辨识的颗粒结构,而流式细胞仪则根据反映胞内全部颗粒差异的色散测量结果进行分类,因此2种方法的分析结果既有联系又不完全一致。[结论]上述结果提示中华绒螯蟹的各种血细胞之间还有尚未了解的差异,因此可能存在更多的细胞种类。图像辅助流式细胞仪既可以清晰地划定设门区间,又能通过图像佐证结果的准确性,还可凭借其高通量分析能力进一步确保结果的可靠性。该方法有助于促进水生动物血细胞的自动化分类分析与研究。     

凡纳滨对虾肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选

为获得具有消化酶活性且安全的益生菌,从凡纳滨对虾肠道中初步分离得到576株细菌,对菌株进行产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的定性及定量测试,筛选出产酶种类多且产酶能力强的菌株11株。对筛选出的11株菌进行了幼虾浸浴实验、药敏性实验和溶血性实验,以评价其生物安全性。将11株菌的菌悬液添加到凡纳滨对虾幼虾的养殖水体中进行浸浴实验,浸浴结束后用鳗弧菌进行刺激,测定不同浸浴组幼虾相关免疫基因的相对表达量,以确定其对幼虾的保护效果。综合消化酶活性、菌株对幼虾的保护效果及生物安全性,筛选得到4株效果较好的菌株。菌株的16S r DNA分子鉴定结果表明,细菌1号、2号和4号分别与芽孢杆菌(Bacillus sp.PCSAS2-38,GQ284495.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus strain N419,JN400121.1)及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis strain EA26.1,KC758847.1)的相似性均为100%,9号菌株与荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus strain PSB-03,FJ866782.1)相似性达到99%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。     

中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal)的重组表达及活性分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal, GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。     

图像辅助流式细胞仪在鲫鱼血细胞分析中的应用

[目的]探讨图像辅助流式细胞仪在鲫鱼血细胞分析中的应用。[方法]将图像辅助流式细胞仪引入鲫鱼血细胞分类计数分析,并进一步用于急性铜离子胁迫对鲫鱼血细胞影响的机制探讨。[结果]多维全景分析仪独有的图像辨识功能较好地解决了有核红细胞对不同类群细胞分群设门分析的干扰,测量鲫鱼白细胞类群占比为1.18%~1.43%,与同类研究结果一致;120 mg/L铜离子急性刺激能够导致鲫鱼白细胞计数下降,并提示细胞水肿是铜离子的一种急性毒性效应。[结论]该研究建立了一种适用于含有核红细胞样本的操作简便、自动化程度较高的血细胞分群分析方法,可为同类研究提供新的技术手段。     

凡纳滨对虾JAK和STAT基因在苏云金芽孢杆菌侵染过程中的表达变化分析

为了分析凡纳滨对虾JAK(Lv-JAK)和STAT(Lv-STAT)基因应答病原菌侵染的表达变化特征,本实验利用半定量PCR技术分析了Lv-JAK和Lv-STAT基因的组织表达特征,并利用实时荧光定量PCR技术分析了其在苏云金芽孢杆菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-JAK和Lv-STAT基因在凡纳滨对虾的9种组织中有不同程度的表达,均在鳃、肠道和心脏中表达量较高。苏云金芽孢杆菌感染后,在鳃组织中,Lv-JAK和Lv-STAT基因的相对表达量在感染的中晚期(24~72 h)显著上调表达;在肠道组织中,Lv-JAK基因的相对表达量在感染后的6和24 h显著上调,Lv-STAT基因的相对表达量在感染后的24和72 h显著上调。综上表明,JAK和STAT基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由苏云金芽孢杆菌引发的天然免疫应答过程,探讨凡纳滨对虾JAK和STAT基因应答苏云金芽孢杆菌感染的表达变化特征,有助于研究对虾JAK/STAT通路在应答病原菌侵染过程中的功能和作用机制。     

鱼类血细胞研究进展

鱼类血细胞研究对于系统了解其免疫系统的应答机制及鱼类疾病的防控具有重要意义。从血细胞发生、发育及分化、功能及研究方法 4个方面综述了鱼类血细胞研究进展,并对其今后的研究方向进行了展望。     

中国明对虾C 型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。     

凡纳滨对虾血细胞图像流式检测与病原感染分析

血细胞是机体免疫系统的核心,为了对其进行精细的类群划分和功能分析,了解动物免疫防御的机制,实验以体质量为17～23 g的凡纳滨对虾为对象,分别根据显微观察的胞内可辨颗粒结构和流式测量的细胞侧向散射特征探讨了其血淋巴的细胞类群,并进一步探讨了在副溶血性弧菌和白斑综合征病毒两种病原感染早期,主要响应的血细胞类群及其数量变化等特征。结果显示,两种方法都能从凡纳滨对虾血淋巴中辨识出无颗粒、小颗粒、中颗粒以及大颗粒四种血细胞,其中无颗粒细胞占比都接近70%,另外3种颗粒细胞合计占比均为30%左右,但细分比例统计有差异。脂质染料DID显示胞内颗粒普遍被膜,中颗粒和大颗粒细胞内的颗粒大小较均匀,提示了其内源性的形成机制;大颗粒细胞大小分布区间最窄且充满颗粒,表明其可能处于发育终末阶段,功能与分泌相关。通过测量发现,在两种病原感染早期,承担吞噬功能的无颗粒细胞和小颗粒细胞是主要响应类群,总体趋势均表现为细胞计数先降后升,推测感染后大量血细胞由于被用于清除病原而导致短时间内损失较多。副溶血性弧菌感染24 h后细胞总数降至低点,而白斑综合征病毒感染后的低点出现在36～48 h,相较略有延后并持续较长时间,...     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)的克隆及表达分析

[目的]研究丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)在凡纳滨对虾天然免疫应答过程中的作用。[方法]利用PCR技术克隆凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP),并进行生物信息学分析,进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行组织表达分析以及白斑杆状病毒(WSSV)刺激后的表达变化分析。[结果]成功从凡纳滨对虾体内克隆了Lv-SP基因的开放阅读框ORF,碱基数为1 104 bp,共编码367个氨基酸,在线分析软件预测其蛋白分子量为41 k D,等电点PI为6.93;在线分析软件预测显示:Lv-SP基因预测的氨基酸序列保守性很高,含有1个clip结构域和1个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc);系统进化发生分析表明:Lv-SP氨基酸序列与中国明对虾以及中华绒螯蟹的丝氨酸蛋白酶(SP)同源性较高,而与按蚊、小蜂窝甲虫的SP同源性较低;qRT-PCR分析结果显示:Lv-SP基因在凡纳滨对虾不同组织中均有表达,并且在鳃和血中表达量较高,而在心和肝中表达量较低,病毒WSSV刺激后,Lv-SP基因在48.0 h和72.0 h有显著的上调表达趋势。[结论]Lv-SP基因保守性比较高,并且其在一定程度上参与了对虾应答病毒侵染的免疫反应,推测它有可能作为重要的免疫调控基因在对虾的防御应答过程中发挥作用。     

一种凡纳滨对虾新的C型凝集素基因（LvLc2）的克隆及免疫应答特征

为有效地进行凡纳滨对虾病害防治和健康养殖,探究对虾天然免疫机制,为其免疫防控提供新思路,实验根据本课题组前期转录组结果提示,在凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了一个新的C型凝集素基因(LvLc2, GenBank登录号KR020738)。生物信息学分析显示,LvLc2的ORF区全长465 bp,编码154个氨基酸(aa),5′-UTR为11 bp,3′-UTR为126 bp;其预测的分子量为17.16 ku,理论等电点为4.54;推断其氨基端含有一个由17个aa组成的信号肽序列,羧基端含有一个保守的糖识别结构域(CRD)。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达,其中在肠道中表达量最高,其次为胃、肝胰腺、血细胞等组织或细胞,在肌肉中表达量最低。利用脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)刺激对虾后,比较分析了LvLc2的表达变化特征,不同类型的病原表面多糖可在刺激后不同时期引发LvLc2基因的应答改变,表明其具有潜在的广谱应答模式,同时针对不同病原又具有不同的表达特征,显示了其识别结合和间接免疫效应的差异。对其作用特征的探讨有助于更好地了解对虾C型凝集素在病原感染过程中的功能和作用机制。研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考,在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。