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1.
拟构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的真核表达载体 pcDNA_3GFP,并观察其在 MDCK细胞(大肾细胞系)中的表达。以Not Ⅰ切取GFP后插入真核表达载体pcDNA_3,以BamHⅠ鉴定方向,以LipofectAMINETM将pcDNA3GFP转染至培养的MDC K,经G418筛选pcDNA3GFP阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含GFP cDNA的真核表达载体pcDNA3GFP,并成功转染MDCK,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 GFP基因可在 MDCK细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。 相似文献
2.
以PCR方法克隆得到猪源大肠杆菌ST1基因缺失CooH端了后两个编码密友和终止密码的DNA片段,并以该片段为探针,筛选了以载体pBluescript构建的猪大肠力P55质粒DNA文库,得到插入片段约5.5kb阳性克隆,亚克隆了约0.5kb含ST基因的TaqI酶切片段,并对该基因核苷酸序列进行了分析。应用竞争性ELISA测定了ST基因在不同启动子调控下的表达情况,在T7启动子调控下,ST基因在大肠 相似文献
3.
大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达 总被引:13,自引:0,他引:13
用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的质粒pXSLT1,回收084kb的ST1—LTB融合基因,再将载体pET—28b(+)用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,然后将其与ST1—LTB融合基因连接,转化至受体菌BL21(DE3)中。经EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒pXETSLT1。重组菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS—PAGE和ELISA检测,结果表明重组菌株可以高效表达ST1—LTB融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的3321%,而且无天然ST1生物毒性。 相似文献
4.
1982年,美国国立卫生研究院(NIH)、美国国立医学图书馆(NLM)和美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechology Information, NCBI)等机构开始建立DNA序列数据库(GenBank)。这些数据每18个月增加一倍,由于大量的表达序列标识(ExpressedSequence Tags,EST)收入基因库,现在基因库中的数据每15个月就增加一倍,并且有加速的趋势。 基因库中的基因数据出自30000多种不同的物种,现在每月有600多种新的物种加… 相似文献
5.
应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GPS基因 总被引:1,自引:0,他引:1
将猪繁殖与呼吸综合征症病毒CH-al株囊膜糖蛋白(GP5)一向克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中,与太毒线性DNA(Bac-N-Blue^TMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒rBac=GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后,应用间接免疫荧光试验、SDS-PAGE和Western blot检测表明,GP5基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基 相似文献
6.
大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究 总被引:5,自引:0,他引:5
用限制性核酸内切酶BamHI和Bg1Ⅱ双酶切质粒pBST2-6,获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ(ST1)基因,再将含LacZ基因(编码β-半乳糖苷酶)的载体pUC18用BamHI酶切、碱性磷酸酶处理,然后与ST1基因通过T4DNA连接酶连接,转化至受体菌DH5α中。通过菌落原位杂交筛选,共筛选出53个ST1基因探针杂交阳性的重组子,对其中一个重组子DH5α(pXST1)进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析,证明重组质粒pXST1含有2个正向串连在一起的ST1基因,而且融合在LacZ基因的上游,具有正确的阅读框架。又DH5α(pXST1)菌株能在含X-Gal的LB平板上长成蓝色菌落,而且ELISA也检测到ST1融合蛋白,这表明该菌株能表达具有β-半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ST1—β-半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明,重组菌株DH5α(pXST1)安全无毒,表达的ST1融合蛋白能够诱发BALB/c鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用,这表明DH5α(pXT1)可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。 相似文献
7.
新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析 总被引:12,自引:2,他引:10
本试验首先以NDVF48E9株的基因组RNA为模板,逆转录合成F基因cDNA第一链,再通过PCR技术扩增F基因的cDNA,然后将其克隆到质粒pUC19中,经分子量比较、酶切分析、PCR等方法证明,我们已经获得了NDVF48E9株F基因的阳性克隆。经初步序列分析,FA段核苷酸序列与参考株(D26/76)序列同源性为89%,FB段同源性为91%。二者的氨基酸序列表明,F48E9株F蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即112RRQRR116F117。这两段序列中包含的三个Cys残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。 相似文献
8.
胞质磺基转移酶至少有三个基因家族组成,最近纯化到的一个兔羟类固醇磺基转移酶AST-RB2(ST2A8),对羟基固醇和胺类表现出很高的催化活性。为了鉴别此酶,兔的cDNA文库用抗AST-RB2抗体筛选阳性克隆。根据纯化的AST-RB2氨基酸序列,可判定筛选的cDNA克隆为编码AST-RB2的基因。 相似文献
9.
人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达 总被引:6,自引:2,他引:4
Cecropin AD 是由Cecropin A的N 端1 11 位氨基酸残基和Cecropin D 的C 端12 37 位氨基酸残基构成的一个杂合肽,抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Cecropin AD 的氨基酸序列,以酵母偏爱密码设计了Cecropin AD 基因,全长140bp 。采用基因片段化学合成结合PCR 法合成Cecropin AD 基因。合成的Cecropin AD 基因克隆到pCRTM21 上,进行DNA 序列测定,证实合成的Cecropin AD 基因的DNA 序列与设计序列完全一致。将Cecropin 基因定向克隆到大肠杆菌 酵母穿梭质粒pCLWA2 的Bam HI和Sal Ⅰ位点上,构建成含Cecropin 基因的重组质粒pCAD,将重组质粒转化入宿主酵母AB103 ,以大肠杆菌K12D31 为指示菌,用活性蛋白酸性PAGE 法测定,具有抑菌活性,表明Cecropin 基因在酵母中获得表达。 相似文献
10.
将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ(STⅠ)结构基因的质粒pBST2-6用限制性内切酶BammHⅠ和BglⅡ消化,经3%琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收147bpSTⅠ基因片段,再将含LacZ基因(编码β-半乳糖苷酶)的载体pUC18用BamHⅠ消化、碱性磷酸酶处理,然后将处理的pUC18DNA与147bpSTⅠDNA通过T4DNA连接酶进行粘性末端连接,转化至受体菌DH5α。通过菌落原位杂交筛选,共筛选出53个为STⅠ基因探针杂交阳性的菌株。杂文阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后,经限制性内切酶分析和DNA序列分析,证明重组质粒pXSTⅠ含有2个连接在一起的STⅠ基因片段,其连接方向是正向的,具有正确的阅读框架。又DH5α(pXSTⅠ)菌株能在含X-Gal的LB平板上呈蓝色菌落.表明该菌株能表达具有β-半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ-β-半乳糖苷酶融合蛋白。 相似文献
11.
将编码人雄激素受体(hAR)的雄素结合区(LBD)的cDNA片段(1005bp)克隆到由P1启动子控制的硫氧还蛋白表达载体pTrxFus上,构建了表达质粒pTrxAR,并转化到大肠杆菌G1724中,经色氨酸诱导表达后,SDS-PAGE分析,可观察到一高效表达的融合蛋白产物,此融合蛋白 分子了量与理论值相吻合,氨基酸组分分析证明了LBD目的基因的表达。 相似文献
12.
马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆… 总被引:1,自引:0,他引:1
用聚合酶链式反应(PCR)技术,从马立克氏病病毒(MDV)GA株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组DNA中扩增出MDV糖蛋白(gD)抗原基因1209bp编码序列。将该PCR扩增产物于EcoRI和KpnⅠ位点克隆进行pUC18质粒载体中。将gD重组pUC18质粒DNA用Digoxigenin(Dig)标记后,在Southern blot中,该探针能识别MDV基因组DNA的Bam HI-A克隆中的A 相似文献
13.
新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析 总被引:16,自引:4,他引:12
采用异硫氰酸胍/酚/氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒(NDV)F48E9株及2个东北地区分离株DB3、DB5基因组RNA,并以其为模板经反转录合成F基因cDNA第1链,再利用PCR技术分段增出F基因的cDNA。F48E9、DB3和DB5株F基因的cDNA经酶切修饰后,插入pUC19的多克隆位点中,转化感受态E。cdi DH5a,经相对分子质量比较、酶切分析及PCR等鉴定方法筛选出F48E9、DB3和 相似文献
14.
利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)HZ株VP2基因,并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析,同时将 VP2基因与真核表达载体 pcDNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列共 1356bp,分析表明HZ株与欧洲超强毒株UK661高度相似,同时将VP2基因正向插入pcDNA3的CMV启动子下游,得到了VP2基因的真核表达质粒。为IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。 相似文献
15.
将构建的pBST2~6工程菌质粒用限制性内切酶BamHI/BglⅡ酶切,经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱,回收147bp的目的ST1基因。随之将该基因分别重组到能有效表达K99菌毛抗原和LacZ酶的pGK99之K99基因BglⅡ位点和pUC18的BamHI位点中。通过ST1基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及DNA序列分析,筛选并鉴定出了理想重组子,从而构建出了能分别表达ST1融合基因产物的工程菌株pSK219和pXST1。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒SY毒株S1基因的RT-PCR扩增与克隆 总被引:2,自引:0,他引:2
利用 IBV S1基因特异性寡聚核苷酸引物,经 RT-PCR技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 SY毒株 S1基因,得到预期的1.7kb片段。并将扩增所得cDNA插入克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点,在大肠杆菌DH_(5a)中实现目的基因的克隆,获得SY毒株S1基因重组质粒。 相似文献
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将马立克氏病病毒(MDV)GA株基因文库中的BamHII3和K3克隆质粒分别用双酶切消化,获得2.8kb的BamHI-SalⅠ片段和1.1kb的BamHI-EcoRI片段,然后将这2个片段定向克隆于载体pUR222中,构建了含MDV糖蛋白B(gB)基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达,设计了1对带有酶切位点的引物,用PCR扩增了MDVgB基因部分片段,并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中,得到起始密码子前带有EcoRI酶切位点的MDVgB基因克隆,再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBF14中,DNA序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型BmNPV共转染家蚕细胞,用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞,可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应 相似文献
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ST_1肠毒素基因的合成、克隆及其融合蛋白的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
用DNA合成仪合成了编码ST1肠毒素第58到72位氨基酸残基的DNA片段,并将其与表达融合蛋白的载体PGEMEX-1重组,转化受体菌JM109(DE-3)。筛选出的重组克隆经过1PTG4小时诱导,ST1融合蛋白的产量超过超过细菌蛋白总量的40%,最高达59.9%。 相似文献
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用DNA合成仪合成了编码ST1肠毒素第58到72位氨基酸残基的DNA片段,并将其与表达融合蛋白的载体PGEMEX-1重组,转化受体菌JM109(DE-3)筛选出重组克隆经过1PTG4小时诱导,ST1融合蛋白的产量超过细菌蛋白总量的40%,最高达59.9%。 相似文献
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本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒(SY毒株)进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原S1基因进行了RT-PCR扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的SY毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株SY株不同于参考毒株澳大利亚T、H52、M41,且不同于国内其它流行株HD、HB、XB、DB等,是一个新的变异株。 利用IBV S1基因特异性寡聚核苷酸引物,经RT-PCR扩增SY毒株的S1基因,得到预期的约1.7Kb片段;并将扩增所得cDNA插入克隆质粒pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ位点,在大肠杆菌DH5a中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及PCR鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到S1基因全长1640bp,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件DNASIS、PROSIS、MEGA等软件对S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明:分离株SY与7株参考株和国内流行株HD株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到80%,这就提示我们SY毒 相似文献