大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明，ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）工程菌株可作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—K99／LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。     

PCR在ST_1基因扩增及其基因探针制备上的应用

本研究旨在将ST_1基因插入到能表达K_(99)抗原的质粒载体适当位点中,构建成能表达ST_1—K_(99)两种抗原的工程菌苗.我们应用PCR成功地扩增了该基因,并进行了ST_1基因探针的制备,为下一步基因重组和重组子筛选提供了有利条件,还为ETEC流行病学调查提供了新方法.     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

伪狂犬病病毒闽A株gE主要抗原表位基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据伪狂犬病病毒 Rise毒株 g E基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用 PCR方法 ,从伪狂犬病病毒闽 A株 DNA扩增出 5 5 8bp片段。将该片段克隆到 p UC19质粒中 ,测序正确后再将其克隆到表达质粒 p ET- 2 8a中 ,以 BL 2 1(DE3)为宿主菌 ,在 IPTG诱导下获得了高效表达。经 SDS- PAGE及 Western- blotting鉴定分析 ,表达蛋白大小约 2 30 0 0 ,蛋白薄层扫描分析表明 ,该蛋白约占菌体总蛋白的 30 %。     

Dc-Chol/DOPE介导siRNA对HeLa细胞的高效转染

如何把小干涉RNA有效地递送到体内特异的靶细胞是RNA干涉技术发展中的主要障碍.阳离子脂质体DC-Chol/DOPE已经成功地用于DNA药物的体内递送.研究表明DC-Chol/DOPE介导siRNA对HeLa细胞的转染与商品化的转染试剂Lipofectamine 2000一样高效,而对细胞的毒性则要小得多.     

转基因动物乳腺通用表达载体的构建

为进一步研究羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因在转基因大动物中的应用,利用克隆的羊ＢＬＧ基因５′和３′区的５ｋｂ和４．２ｋｂ构建乳腺表达载体。为有效利用内含子的作用,克隆了羊ＢＬＧ第１和第２内含子,进行了序列分析,并将２个内含子进行了拼接,构建了有效的乳腺表达载体。该载体方便从原核载体中卸出,并加入３个有利于外源基因插入的克隆位点     

毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因探针的研制

<正> 带有K88ac抗原的毒素源性大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主要致病菌。K88抗原是细菌外周的菌毛蛋白,在致病过程中可使细菌粘附到小肠的上皮细胞上,使细菌定居后大量繁殖,产生毒素导致腹泻。对此致病因子自六十年代以来已做了大量的研究,发现K88抗原的合成是多基因控制的,只有一     

大肠杆菌pSLM_(004)质粒的酶切分析及其肠毒素ST_Ⅰ基因探针的制备

利用硷变性及羟基磷灰石柱层析法提纯了大肠杆菌pSLM004质粒,经酶切分析证实了耐热肠毒素(STⅠ)基因片段在pSLM004中的定位,并成功地分离回收了STⅠ基因片段;采用随机引物法对STⅠ基因片段进行了α-32P标记,成功地制备了STⅠ基因探针,菌落杂交效果良好。