富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪制备的关键技术研究

作者综述了制备富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪的研究意义和国内外的研究现状，并介绍了自己的研究进展。用化学合成的方法获得了C briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1，并构建了哺乳动物细胞表达载体。通过显微注射的方法制备了转基因小鼠，sFat-1基因能够在转基因小鼠中产生更多更长链的而且更有价值的DHA以及DPA。在确认sFat-1基因功能的基础上，将载体转染到猪胎儿成纤维细胞，利用阳性的细胞克隆通过核移植方式制备富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪。     

序贯培养法对猪孤雌激活胚胎发育能力的影响

经体外成熟、孤雌激活和培养获得猪胚胎,研究了不同培养体系、共培养体细胞和序贯培养对猪孤雌激活胚胎发育的影响。试验表明:孤雌激活卵母细胞在SOF 10?S培养体系中分裂效果最好,添加胎牛血清的NCSU-23和颗粒细胞对胚胎发育有促进作用,培养6d后发育到桑囊胚的比率增加(P<0.05)。在序贯培养的前3d,SOF培养基(不含葡萄糖)和颗粒细胞对胚胎的发育有促进作用,分裂率(P<0.05)和突破4细胞阻滞的数目显著增加,在培养的后3d,添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞能支持较多胚胎发育到桑囊胚,桑囊胚的发育率为(59.5±3.2)%(P<0.05)。结果表明,SOF培养基和颗粒细胞 添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞的序贯培养系统能较好的促进胚胎的发育。     

乳清酸蛋白基因调控序列的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G-CSF载体的构建

乳清酸蛋白基因经亚克隆、酶切鉴定，并对该基因５′区进行克隆和序列分析，在核实序列正确后，构建了以其为调控序列、指导人Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表达质粒，以用于转基因动物乳腺表达研究。     

体细胞克隆猪的研究与展望

用体细胞核移植的方法生产的克隆猪诞生至今已近5年，虽然同胚胎细胞核移植相比，体细胞核移植技术难度大，成功率低，但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了更深入的研究，在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。综述了用核移植的方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况，并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

转基因动物乳腺通用表达载体的构建

为进一步研究羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因在转基因大动物中的应用,利用克隆的羊ＢＬＧ基因５′和３′区的５ｋｂ和４．２ｋｂ构建乳腺表达载体。为有效利用内含子的作用,克隆了羊ＢＬＧ第１和第２内含子,进行了序列分析,并将２个内含子进行了拼接,构建了有效的乳腺表达载体。该载体方便从原核载体中卸出,并加入３个有利于外源基因插入的克隆位点     

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转基因小鼠的建立

利用小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控序列指导人Ｇ－ＣＳＦ基因所构建的融合基因,注射小鼠受精卵,ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,获得了人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠,整合率为２．３７％,这一模型的建立为转基因大动物生产提供了资料和方法。     

关中奶山羊BAC文库构建条件研究

BAC(bacterialartificialchromosome,细菌人工染色体)是一种新发展起来的构建高等生物基因组文库的重要方法。由于关中奶山羊产奶性能好,成为制备乳腺生物反应器的理想动物之一,故对关中奶山羊BAC文库的构建条件进行了研究。用BamH 部分酶切关中奶山羊的基因组,用CHEF(箝位匀强电场)凝胶电泳分离大片段DNA,以电透析法回收DNA后,与酶切脱磷的pBeloBAC11载体连接,然后电激转化感受态细胞DH10β,得到了数千个阳性克隆,插入片段平均为30～40kb。在此过程中摸索了BAC载体制备、高分子量DNA制备、酶切、连接和电激转化等一系列环节对高效转化产生大片段DNA克隆的影响。     

IGF-I、TGF-α、bFGF对猪卵母细胞体外成熟和卵裂的影响

 研究了IGF-I、bFGF、TGF-α 3种细胞因子单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后卵裂的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明，3种细胞因子对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应（1）20 ng·ml-1的IGF-I的成熟率和卵裂率显著的高于对照组和10、30、40、50、100 ng·ml-1组[（85.3 ±2.11) %，（85.4±2.81）%；（71.1 ±1.91）%，（62.5 ±0.98）%；（77.5 ±2.5）%，（59.1 ±3.93）%；（61.9 ±1.72）%，（54.3 ±3.48）%；（58.6 ±4.26）%，（53.1 ±1.23）%；（44.4 ±5.10）%，（49.8 ±3.55）%；（33.9 ±3.48）%，（46.1 ±3.59）%，P <0.05)，当IGF-I的浓度达到100 ng·ml-1时,成熟率（33.9±3.48）%和卵裂率（46.1±3.59）% 降低，与其它各组相比差异显著（P < 0. 05）。（2）20 ng·ml-1的bFGF的成熟率（85.0 ±1.70）%和卵裂率（85.0±2.82）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（3）15 ng·ml-1的TGF-α的成熟率（86.9±0.46）%和卵裂率（86.3±2.01）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（4）15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1bFGF联用组，卵母细胞成熟率和分裂率显著高于20 ng·ml-1 bFGF和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；与20 ng·ml-1 bFGF、20 ng·ml-1 IGF-I和15 ng·ml-1 TGF-α三者联用组。[（89.2±1.44）%和（88.8±0.17）%.（75.6±0.98）%和（78.3±1.65）%；（77.2±2.54）%和（80.2±2.26）%；（76.4±1.28）%和（77.4±3.73）%，P <0.05]。