人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转基因小鼠的建立

利用小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控序列指导人Ｇ－ＣＳＦ基因所构建的融合基因,注射小鼠受精卵,ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,获得了人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠,整合率为２．３７％,这一模型的建立为转基因大动物生产提供了资料和方法。     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

天祝白牦牛SRY基因克隆与原核表达

从天祝白牦牛的基因组DNA中扩增了SRY（Sex-determining Region on the Y Chromosome，SRY）基因编码区序列，将其克隆至pGEM-T easy载体并送至生物公司测序，天祝白牦牛SRY基因编码区长687 bp，编码229个氨基酸；对牦牛和奶牛的SRY基因编码区进行序列比对，发现存在2个碱基的变异，造成1个氨基酸的变异；将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体，成功构建了表达载体pET-28a/SRY；把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中，在合适的条件下诱导该大肠杆菌，SRY蛋白得到了大量表达；对表达产物进行了Western-blot检测，进一步确定牦牛SRY蛋白得到表达。     

猪resistin(Retn)基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。     

抗生素对韭菜根尖培养植株再生的影响

卡那霉素 (Km)和G41 8对韭菜根尖培养植株再生均有抑制作用 ,随浓度提高愈伤组织和芽的分化频率逐渐降低 ,G41 8的抑制作用更加显著 ,当Km取 2 0mg L、G41 8取 1 5mg L时 ,不能诱导成芽。羧苄青霉素 (Crb)和噻孢霉素 (Cef)对韭菜的植株再生也有抑制作用 ,当Crb≥ 3 0 0mg L、Cef≥ 2 0 0mg L时 ,严重影响愈伤组织和芽的分化频率 ,出芽数也迅速减少 ,抑制作用随浓度提高而增强。在所取浓度范围内Timen tin对植株再生的抑制作用较小 ,对愈伤组织和芽的分化频率影响不大 ,但是随着Ti mentin浓度提高 ,出芽数逐渐降低 ,当Timentin =50 0mg L时 ,出芽数降低到对照的49 4%。     

水稻无侧根突变体RM109的氧化还原代谢

比较无侧根突变体RM1 0 9和原品种大力根琥珀酸脱氢酶 (SDH)的活性发现 :RM1 0 9为大力的 60 %～ 70 % ,还原剂处理下大力的SDH活性显著增加 ,而RM1 0 9无变化。RM1 0 9的该酶受单显性基因控制。RM1 0 9对NAA、TIBA的耐性明显增加 ,对H2 O2 的耐性明显下降。结果表明 :氧化还原代谢有突变     

水稻胚乳突变体的诱发及其微卫星分子标记鉴定

用 3 50Gy6 0 Coγ射线辐照高表观直链淀粉含量 (apparentamylosecontent,AAC)早籼稻新品种金早 97 47,筛选鉴定出 4个暗胚乳突变体和 2个云雾状胚乳突变体。AAC测定表明 ,暗胚乳和云雾状胚乳突变的AAC明显比原亲本低。以Wxup2 485为引物 ,发现两类胚乳突变的Wx基因微卫星分子标记相同 ,与原亲本显著不同 ,前者为 (CT) 1 8 (CT) 1 8,后者为 (CT) 1 1 (CT) 1 1。     

STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况,并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明,转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后,细胞增殖能力增强,染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代,表明导入STAT3基因后,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。     

赤羽病病毒囊膜糖蛋白G1基因的截短表达、纯化及间接ELISA诊断方法的建立

为获得赤羽病病毒（Akabane Virus, AKAV）囊膜糖蛋白重组抗原作诊断应用研究,通过软件分析AKAV OBE-1株的囊膜糖蛋白G1的氨基酸序列,筛选出抗原性较好的基因片段G1-2作为目的片段,经RT-PCR扩增后,插入pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段定向亚克隆于pET-28a (+)表达载体中,转化至BL21 (DE3)感受态细胞中进行诱导表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析,诱导表达产物以包涵体的形式存在,大小约为40ku,且具有免疫学活性。亲和纯化后的融合蛋白浓度为2mg/ml,纯度为92.6%。以该融合蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为20g/ml,血清最佳稀释度为1:200。交叉试验表明该方法对牛常见的6种疾病阳性血清无交叉反应。应用该方法对病毒微量中和试验检测过的云南（77份）和内蒙（70份）牛血清样品进行了检测。以中和试验为参照,通过统计学处理,得出两地临界值分别为0.493和0.488,本方法的特异性为73%和86.9%,二者的符和率分别为80%和85.9%。     

早籼新品种浙辐910的培育、特征特性与生产应用

浙辐 91 0系用浙辐 2 1 9与广东优质籼稻长丝软占杂交、杂种F1辅以 3 0 0Gyγ射线辐照处理后选育而成的早籼新品种。浙辐 91 0在湖南省湘潭市 1 997、1 998两年区试中 ,比对照品种湘早籼 1 3分别增产 6 4% (达显著水平 )和 6 9%。在浙江省金华市 1 997、1 998两年区试中 ,浙辐 91 0比对照品种浙 852分别增产 5 5%和 9 8% (达显著水平 )。已分别于 1 999年 1月和 2 0 0 0年 4月通过湖南省湘潭市和浙江省农作物品种审定委员会审定。经稻米品质分析 ,浙辐 91 0糙米的蛋白质含量达 1 3 2 % ,因此 ,它是一个高蛋白水稻品种。