IBV疫苗株基因组3‘末端序列分析

以5株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）疫苗株（D41、H120GD、H120SH、H52BJZH和H52GD株）和IBV标准强毒M41-E4株的基因组RNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增出1条特异性条带，包括部分核衣壳蛋白（N）基因以及紧接着N基因下游的基因组3‘端非编码区（UTR）。测序结果表明，从D41、H120GD和H120SH株扩增的特异性片段长度为614bp；而从H52BJZH、H52GD和M41-E4株扩增的特异性片段长度为406bp。序列分析发现，被检的6株IBV毒株可分为两组，其中D41、H120GD和H120SH株为一组，核苷酸序列同源性为99.7%-99.8%；而H52BJZH、H52GD和M41-E4株构成另一组，其核苷酸序列同源性为99.3%-100%；两组之间的最大同源性仅为94.6%。在系统性发生进化树上，这两组分别位于不同的分支簇上，国内的H52BJZH、H52GD与国外的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41-E4株以及国外M41株在同一分支簇上。提示国内H52疫苗株与国外H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41-E4株和M41株。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株S1基因的克隆与序列测定

根据基因库中收录的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因的序列 ,设计了一对引物并采用RT -PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒HN99株的S1基因 ,扩增产物进行了克隆、测序 ,获得了IBVHN99株S1基因片段 ,其大小为1 739bp(含前导序列 ) ,其核苷酸序列与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte的S1基因核苷酸序列同源性较低 ,分别为 79.1 %,79.2 %,77.3%,77.8%,79 .4%,有大量的点突变并伴有基因插入和缺失 ;IBVHN99株的S1基因推导的氨基酸与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte株氨基酸的同源性分别为80 .1 %,79.9%,79.5%,78.5%,78.5%,经S1基因系统进化分析 ,提示IBVHN99株与其它各毒株的亲缘关系较远 ,初步证实IBVHN99株为一新的IBV毒株     

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒W93疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因序列，设计了两对引物并以RT－PCR特异性扩增出嗜肾型IBV W93疫苗株的S1基因，基因产物大小为1.62kb，与设计相符，对其进行序列测定后，与标准毒株H52、H120、M41、BEAU株的S1基因进行同源性比较，结果表明，W93株与H52、H120、M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为96．8％、97．1％、96．9％和96．8％，由此可以看出嗜肾型IBV W93疫苗株与标准毒株在S1基因上具有高度的同源性。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了一对引物,通过RT-PCR特异性扩增出IBV H120疫苗株的S1基因,产物大小为1.62 kb,与设计相符.同源性比较结果显示,H120株与H52、M41和BEAU株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为97.1 %、96.9 %和96.8 %,表明IBV H120疫苗株与标准毒株的S1基因具有高度的同源性.     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了一对引物，通过：RT-PCR特异性扩增出IBV H120疫苗株的S1基因，产物大小为1．62kb，与设计相符。同源性比较结果显示，H120株与H52、M41和BEAU株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为97．1％、96．9％和96．8％，表明IBV H120疫苗株与标准毒株的S1基因具有高度的同源性。     

传染性支气管炎病毒疫苗株H52的全基因组克隆与分析

采用RT-PCR方法克隆测定传染性支气管炎病毒（Infections Bronchitis Virus,IBV）疫苗株H52全基因组序列,并与其它已知全基因组序列的我国分离株进行比较分析,以分析我国IBV地方分离株与疫苗株的分子遗传关系。结果表明,H52基因组全长为27630bp（不包括polyA）,A＋T含量为61．8％,它与我国IBV分离株全基因组同源性在83．9％～95．2％之间,其中与KQ6的同源性最高（95．2％）,与其余株均在88％以下。在基因组内基因的同源性中,以S1、S2与E变异最大,除KQ6外,其余各株（含台湾株）与H52在S1蛋白上的同源性只有72．4％～80．7％,在S2蛋白上的同源性为85．5％～88．1％,E蛋白为82．9％～93．3％。系统进化分析表明,国内分离株,除KQ6外,在进化分支中已独立于H52和其它Massachusetts型衍生毒株。H52与我国地方分离株存在较大的分子遗传差异,这些差异可能导致单纯Massachusetts型疫苗（如H120,H52）不能有效地免疫保护我国的鸡群。     

传染性支气管炎DN-1分离株S1基因的克隆与序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了1对引物,通过RT-PCR特异性扩增出DN-1株的S1基因,产物为1.7 kb,与设计相符.同源性比较结果显示,DN-1株与H52、H120株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为99.7%、99.2%,表明IBV DN-1分离株与疫苗株的S1基因具有高度的同源性.     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

本研究选取有代表意义的9株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）国内分离株．利用所设计的一对特异引物，通过RT—PCR的方法成功地扩增了膜蛋白基因即M基因全长片段．通过克隆、序列测定获得了9个分离毒株M基因的全长核苷酸序列。并将各IBV国内分离株与GenBank中注册的一些毒株的M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较、系统进化关系分析发现：IBV中国地方分离毒株大部分属于Mass型；不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异，从ATG至第150bp区段的核苷酸序列变异频率最高；IBV中国地方分离株M基因的变异属于高频率的同义突变；国内的IBV分离株分为两个基因群，1群分离毒株与GenBank中Mass型的毒株亲缘关系较近．毒株间核苷酸序列同源性为95．7%～100％，其相应的氨基酸序列同源性为98．2%～100%；Ⅱ群分离毒株与众多参考毒株的亲缘关系都比较远，毒株间彼此核苷酸序列同源性为89．7％～91．9%，氮基酸序列同源性为92．0-96．0%。     

IBV 3株分离株的血清中和试验及S1基因同源性分析

通过血清中和试验、RT-PCR、核酸序列分析和S1基因的同源性分析，表明鸡传染性支气管炎病毒（IBV）BJ9601、HN9604与M41株的血清中和效价最高，其次为H120，TJ9602与试验毒株的血清中和效价较低。BJ9601、HN9604的S1基因与H120和H52的同源性很高，与H120和H52同在一个分支，其来源与H120或H52有密切关系。TJ9602的S1基因只与LDT3的同源性达到93％，共同形成一个分支，与其他毒株的同源性均在88％以下。血清中和试验和S1基因同源性之间存在较高的相关性，但并不能达到完全的吻合，即血清中和效价最高的毒株之间S1基因的同源性并不是最高的。在GenBank中登记的IBV中国大陆分离株的S1基因可分为3个基因群，其中Ⅰ群和Ⅱ群是主要的流行毒株，共有38个分离毒株，占90．48％。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因5′端的变异

对自海南省、广西省发生鸡传染性支气管炎 (IB)鸡群分离的 4株 IBV分离株 (Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98、GX- 2 /98)的主要免疫原纤突蛋白 S1基因经 RT- PCR扩增其 5′端约 1.2 kb的目的片段 ,将其插入载体 p MD 18- T中 ,在大肠杆菌中实现目的基因的克隆。对克隆的目的基因经限制性酶切分析及 PCR鉴定后 ,以双脱氧链终止法测定其核苷酸序列 ,并与 Gen Bank中的参考毒株 (H12 0、SD- 1/97和 Holte)相应序列作比较 ,分析其同源性。结果表明 ,Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98及 SD- 1/97与疫苗株 H12 0的核苷酸序列同源性分别为 99.5 %、99.2 %、97.9%和99.5 % ,其推导氨基酸序列同源性分别为 99.1%、98.9%、96 .9%和 99.2 %。 GX- 2 /98与 Holte株的核苷酸序列同源率为 99.0 % ,其推导的氨基酸序列同源性为 98.6 % ,而与其他中国分离株的核苷酸序列的同源性仅为 70 %左右 ,氨基酸序列的同源性仅为 6 8%左右。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒变异株的比较研究

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）变异株Ｈ９５提纯样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ,证明Ｈ９５株单抗ＤＥ７和Ｍ４１株单抗６ＤＨ８均能识别Ｈ９５株５４０００蛋白多肽。采用单抗、多抗介导间接ＥＬＩＳＡ试验表明,Ｈ９５毒株能与抗ＩＢＶＭ４１Ｎ蛋白单抗６ＤＨ８和ＩＢＶＭ蛋白单抗ＭＣ发生反应,也能与抗Ｍ４１、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｔ、Ｈ５２、Ｎ１１５和分离株Ｃ９００１、ＤＬＺ９１１１的多抗血清反应,同时抗Ｈ９５株的４株单抗、多抗血清也能与上述毒株反应。卵磷脂酶Ｃ处理的Ｈ９５株的血凝活性能被相应的Ｈ９５株的单克隆抗体和高免血清所抑制,也能被Ｍ４１单抗和高免血清所抑制。通过ＲＴ－ＰＣＲ获得了Ｈ９５毒株的免疫原基因Ｓ１,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＩＢＶ的Ｓ探针检测呈阳性。     

国产IBV疫苗株核衣壳蛋白基因的亲缘关系

利用自行设计的引物Cx和Cs，通过RT－PCR方法分别扩增出鸡传染性支气管炎病毒（IBV）D41株，H120GD株、H120SH株、H52GD株等4个国产疫苗株和标准强毒M41－E4株完整的N基因cDNA,然后将其分别克隆到pGEM T-Easy或pMD 18-T载体中并测序。测序结果表明，这5个IBV毒株可分2组，其中D41株，H120GD株和H120SH株为一组，它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％－99．8％和99．0％－99．5％，而H52GD株与M41－E4株构成另一组，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％和99．5％；而2组之间的最大同源性仅为91．0％和93．2％。在系统发生进化树上，这2组分别位于不同的分支簇上。值得注意的是，国内的H52GD株与国外报道的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41－E4株以及国外报道的M41株在同一分支簇上。这一结果表明，国内的H52GD疫苗株与国外报道的H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41－E4株和M41株。     

IBV D41株主要结构基因及3′端非编码区序列分析

采用反转录及聚合酶链式反应 ( RT-PCR) ,成功地扩增出鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV)人工致弱毒D41株 S1基因、M基因、N基因和基因组 3′端非编码区 ( U TR)的 c DNA。序列测定结果表明 :D41株的 S1基因全长 1611bp(从 ATG到 S前体蛋白裂解位点 ) ,编码一条由 53 7个氨基酸组成的多肽 ;M基因全长 678bp,编码一条由 2 2 6个氨基酸组成的多肽 ;N基因全长 12 3 0 bp,编码一条由 410个氨基酸残基组成的多肽 ,3′端 UTR长度为52 5bp,其中高变区 ( HVR)长度为 2 2 5bp。与国内外已报道的一些 IBV标准毒株的相应基因序列进行核苷酸序列同源性分析后发现 :D41株与麻省血清型的毒株同源性最高 ,尤其与国际常用的标准疫苗株 H52和 H12 0的亲缘关系最接近。但它与国内“腺胃型”毒株 QXIBV在系统发生进化树上却相隔较远     

2006年至2010年山东省鸡传染性支气管炎病毒分子变异的研究

为研究山东省鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异规律,本研究2006年～2010年从山东省发病的商品鸡中分离鉴定了17株IBV,并对其S1基因、N基因和M基因分别进行RT-PCR扩增、测序及遗传进化分析.序列分析结果表明:与疫苗株H120相比,17个分离株S1蛋白的变异程度较大,存在广泛的基因突变和氨基酸替代,多数病毒株还存在氨基酸的插入;N蛋白无碱基的缺失和插入,仅存在核苷酸的突变和氨基酸的替代;M蛋白除病毒株CK/CH/SD09/005插入3个碱基外,其它16个分离株仅存在少数的碱基突变和氨基酸替代.S1基因、N基因和M基因的系统进化分析结果表明多数分离株的3个基因在进化上相对平行,与国内分离株LX4同属一个进化分支,同源性较高;分离株SDYT0605的3个基因与疫苗株H120同源性较高,可能是免疫压力下变异的疫苗株;分离株SDTA06111、SDWF0608和CK/CH/SD09/005的S1基因、N基因和M基因分属于不同的进化分支,可能发生了基因重组.本研究结果显示基因突变、插入和不同基因之间的重组是免疫压力下IBV变异的主要方式.     

4株鸡肾型IBV陕西分离株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

采用RT—PCR方法对近年来本实验室分离的4株肾型IBV陕西分离株的纤突蛋白S1基因、膜蛋白基因（M）和核蛋白基因（N）分别进行扩增,测序后进行遗传变异分析。结果显示：与肾型疫苗株w93相比,各分离株S1基因均存在广泛的点突变,并且都存在基因插入现象,分离株之间氨基酸同源性为75．8％～99．4％;M基因除了存在点突变外,W09和WNl2在其5’端还存在9个核苷酸的缺失,分离株之间氨基酸同源性为91．0％～99．6％;N基N无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为99．3％～99．5％。4株IBV分离株在S1、M和N基因氨基酸系统进化树上分属于不同的进化群,且都与较早的肾型IBV陕西分离株w118遗传距离较远。结果表明,4株鸡肾型IBV流行毒株的s1、M和N基因均存在不同程度变异,这可能是免疫鸡群肾型鸡传染性支气管炎长期流行的主要原因．     

鸽源冠状病毒PSH中国分离株S1基因克隆及分子进化分析

对分离鉴定的鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析.结果表明其S1基因由1 626个核苷酸组成,编码541个氨基酸,S蛋白的切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR）,与常见的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S蛋白切割识别位点相似（RRF/SRR）.该病毒与火鸡蓝冠病病毒（TCV）Gh、G1株S1基因推导的氨基酸同源性仅为24.7%、25%,而与IBV H52、H120、M41、Beau、Conn、Gray、Hotel、SH1、SH2、SH5、SH6基因推导的氨基酸同源性在75.0%～99.6%,其中与SH2、SH5的氨基酸同源性更是达到了99.6%,进一步证明该冠状病毒可能来源于IBV.     

鸡传染性支气管炎病毒华南分离株核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ）核蛋白基因序列,设计并合成 １ 对引物。应用这对引物,以 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 特异性扩增出华南分离株（ Ｈ Ｎ 株）的核蛋白基因,基因产物大小为 １５ ｋｂ , 与设计相符。对 Ｈ Ｎ 株部分核蛋白基因进行序列测定,并与标准毒株 Ｈ５２、 Ｍ ４１、 Ｂｅａｕ 和 Ｇｒａｙ 的核蛋白基因进行同源性比较,结果表明, Ｈ Ｎ 株与 Ｈ５２、 Ｍ ４１、 Ｂｅａｕ 和 Ｇｒａｙ 株的核酸同源性分别为 ８５％ 、８４％ ８４％ 和 ８６％ 。由此可以看出, Ｈ Ｎ 株与标准毒株在核蛋白基因上存在一定的差异。     

肾型鸡传染性支气管炎病毒X株S1基因序列的测定及同源性分析

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV) S1基因序列 ,设计了 2对引物并以 RT- PCR特异性扩增出IBV X株的 S1基因 ,基因产物大小为 1.6 4kb,与设计相符 ,对其进行序列测定后 ,与标准毒株 H5 2、H12 0、M41、BEAU和澳大利亚 T株的 S1基因进行同源性比较。结果表明 ,X株与 H5 2、H12 0、M41、BEAU和澳大利亚 T株的核苷酸序列的同源性分别为 75 .8%、76 .1%、76 .3%、75 .5 %和 76 .9%,由此可以看出 ,IBV X株与标准毒株在 S1基因上存在较大差异。