犬新孢子虫AMA1基因的生物信息学分析及原核表达载体构建

为了解新孢子虫AMA1基因的生物信息学特性,并构建重组原核表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。本试验对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,构建了重组表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。结果显示,克隆的Nc AMA1基因片段长1 695 bp,与GenBank(AB265823.1)上发表的基因序列同源性99.9%;Nc AMA1基因编码蛋白等电点为5.43,在其N端及C端分别存在一个跨膜区,为不溶性蛋白,且Nc AMA1蛋白抗原指数较高,有潜在疫苗研究价值。     

犬新孢子虫SRS9基因真核重组质粒的构建及在Vero细胞中表达

为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。     

牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的克隆与生物信息学分析

为了解牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的生物学特性,本试验提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7融合基因重组克隆质粒,并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果,NcSRS2基因扩增片段大小为1 061 bp,NcGRA7基因扩增片段大小为364 bp,NcSRS2-NcGRA7融合基因扩增片段大小为1 482 bp;获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确;测序分析表明,与Gen-Bank中已发表的美国株犬新孢子虫(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性为99%;经DNAman等软件分析,预测NcSRS2-NcGRA7融合蛋白抗原指数较高,融合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构中2种蛋白独立折叠,并借助Linker互相连接,功能互不影响。本试验为牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合蛋白的免疫学研究奠定了基础。     

羊源多杀性巴氏杆菌ExbD基因克隆、原核表达及生物信息学分析

旨在克隆和表达羊源多杀性巴氏杆菌的ExbD基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。试验通过PCR成功扩增出目的基因片段,将所回收片段与pET-28a(+)载体进行连接,构建pET-28a(+)-ExbD重组质粒,将所得pET-28a(+)-ExbD重组质粒经双酶切鉴定后转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过自诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果显示:扩增出390 bp的目的基因,诱导表达得到约为19 ku的重组蛋白。经生物信息学分析,该蛋白为疏水性酸性蛋白,属于稳定蛋白,分子式为C_(656)H_(1068)N_(160)O_(193)S_3,分子质量约为14.44 ku,消光系数(L·mol~(-1)·cm~(-1)=280 nm)为6 990,理论等电点是5.16,不稳定系数为35.28(40),总平均疏水性(GRAVY)为0.145,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验通过对ExbD基因的克隆、表达和分析,为进一步探究该基因的功能提供了基础和参考依据。     

禽白血病病毒p27基因的原核表达及生物信息学分析

为了进一步研究禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27蛋白的结构与功能,并获得具有反应原性的重组蛋白p27,试验通过PCR技术克隆p27基因,构建克隆载体pMD19-T-p27,并应用生物信息学软件对获得的p27基因序列进行分析,构建重组表达载体pET-28a-p27,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot对获得的重组蛋白p27进行分析。结果表明:通过PCR技术克隆获得ALV p27基因,并成功构建了克隆载体pMD19-T-p27;生物信息学分析发现,p27蛋白由239个氨基酸组成,分子式为C_(1140)H_(1853)N_(323)O_(339)S_6,理论等电点为6.23,无信号肽和跨膜区,含有8个丝氨酸磷酸化位点和13个苏氨酸磷酸化位点,无糖基化位点,共有9个抗原表位,二级结构和三级结构中以α-螺旋为主;成功构建了重组表达载体pET-28a-p27,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达;诱导6小时时蛋白质表达量最大,分子质量约为27 ku,且以可溶性为主;重组蛋白p27具有较好的反应原性和特异性。说明试验获得了具有反应原性的重组蛋白p27,为建立禽白血病快速诊断方法和新型疫苗的研发提供了理论基础。     

斯氏副柔线虫免疫相关基因CSY原核表达载体的构建及生物信息学分析

采用RT-PCR克隆斯氏副柔线虫CSY基因的CDS区,限制性内切酶对目的片段与pET30a(+)原核表达载体进行双酶切,构建重组表达载体,利用生物信息学软件对该基因理化性质、结构特点进行分析。结果显示:CSY基因全长774bp,编码255个氨基酸,蛋白质理论大小值为29 240,理论等电点为7.53,蛋白质不稳定指数为40.09;跨膜结构和信号肽分析表明CSY蛋白无跨膜区,无信号肽区域。结果表明:成功构建了pET-30a(+)-CSY重组表达载体;生物信息学分析表明CSY蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,可能有7个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位,有望用于斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。     

和田羊Myostatin蛋白成熟肽的基因克隆及原核表达

为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM₀01009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSL1467基因克隆、表达及其蛋白生物信息学分析

试验旨在克隆和表达羊源性类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallea)的BPSL1467基因,并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。以羊源类鼻疽伯克霍尔德菌(BPHN1株)基因组为模板,参照GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌K96243标准株BPSL1467基因序列设计引物,PCR扩增获得目的基因片段,将所得片段与pET-28a(+)载体连接,构建pET-28a(+)-BPSL1467重组质粒。将鉴定正确的pET-28a(+)-BPSL1467重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物。使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA和Protscale相关生物信息学软件对BPSL1467基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,本试验成功克隆了462bp的BPSL1467基因,诱导表达重组蛋白大小约为22ku,主要以包涵体的形式存在。BPSL1467蛋白分子式为C763H1209N203O217S6,分子质量为16 890.58u;其不稳定系数为33.95,属于稳定蛋白;理论等电点(pI)为8.85,为碱性蛋白;总平均疏水性(GRAVY)为-0.190,为亲水性蛋白。该蛋白的二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。本试验结果为深入研究羊源类鼻疽伯克霍尔德菌的BPSL1467基因的分子作用机理提供了参考依据。     

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。     

泰泽隐孢子虫CP15基因的原核表达及抗血清制备

将泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)CP15基因从pMD18-T-CP15重组质粒中切下,连接至pET-28a(+)原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确后,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,并将纯化的重组蛋白免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。结果显示,重组表达载体pET-28a-CP15在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白分子量约为17 kDa。Western blot显示重组蛋白能被泰泽隐孢子虫感染小鼠血清所识别。ELISA结果显示重组蛋白免疫小鼠血清能和泰泽隐孢子虫卵囊可溶性抗原特异性反应,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。     

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

鸡源禽流感H9N2亚型河南分离株NS1基因克隆、序列分析及原核表达

根据H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α（＋）中,构建重组表达质粒pET-32α（＋）-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。     

牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的表达与纯化

试验对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)基因进行克隆、鉴定,并在原核系统中表达。以多杀性巴氏杆菌(CVCC448)强毒株基因组为模板,扩增OmpH基因,连接T载体,经测序鉴定正确后与表达载体pET-28a连接构建重组表达质粒OmpH-pET28a,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21菌株内,抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导,表达产物通过镍离子亲和层析纯化,之后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,OmpH基因的编码区为978 bp,编码326 个氨基酸残基,融合蛋白分子质量约为37 ku。Western blotting检测结果显示,表达的重组蛋白OmpH可与鼠抗多杀性巴氏杆菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。多杀性巴氏杆菌OmpH基因的成功表达,为进一步研究其免疫作用奠定了基础。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。