多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达，并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列（登录号：CP003313.1）设计1对引物，通过PCR扩增获得目的基因片段，构建pET-28a（+）-recN重组质粒并转化E.coliDH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明，试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列，通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku，主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析，recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆，消光系数为24 785，不稳定系数为43.99，属于不稳定蛋白；理论等电点（pI）为5.62，为酸性蛋白；总平均亲水性为-0.316，与试验表达的包涵体蛋白性质相同，即同为疏水性蛋白；recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h，在酵母（体内）中的半衰期>20 h，在大肠杆菌（体内）中的半衰期>10 h；二级结构主要以α-螺旋（64.87%）及无规则卷曲（21.00%）为主；经疏水性分析，预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌感染小鼠脾脏转录组分析

试验旨在探索羊源D型多杀性巴氏杆菌入侵宿主脾脏组织中引发的免疫应答途径。首先利用羊源D型多杀性巴氏杆菌(HN01菌株)感染小鼠,建立羊源D型多杀性巴氏杆菌感染的动物模型;之后利用转录组测序技术获得感染小鼠与正常小鼠的脾脏转录组数据,并使用COG、KOG、eggNOG、GO、KEGG数据库对测序结果中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行功能注释与分析,同时对于显著富集到关键免疫通路的差异表达基因使用STRING软件和KEGG mapper进行蛋白互作分析,筛选出核心通路中起关键作用的基因;最后选取关键的10个基因进行实时荧光定量RT-PCR验证。转录组分析结果显示,与正常组相比,感染组中筛选出3 380个差异表达基因(P<0.01,log₂|FoldChange|≥0.5),其中1 691个基因上调,1 689个下调。基因功能富集分析结果表明,感染组脾脏中的差异表达基因主要发挥信号转导的功能,其主要参与的生物途径包括细胞因子与细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路。蛋白互作分析筛选出约28个核心差异表达基因,结合实时荧光定量RT-PCR验证后,其中9个基因的表达结果与测序一致,分别是C3、Cd4、Cxcl13、Lck、Gnai1、Grap2、IL-6、Cxcr6及Serping1基因。本研究初步证明了脾脏在抵抗多杀性巴氏杆菌入侵中参与了一系列免疫应答反应,为进一步研究羊源D型多杀性巴氏杆菌与宿主之间相互作用的分子机制奠定理论基础。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

水牛MD-2cDNA基因的克隆与原核表达

为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定.采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21( DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Wester...     

综合性大学畜牧兽医专业人才培养的问题及对策

分析综合性大学畜牧兽医专业人才培养的目标定位、优势和不足等问题,提出加强综合性大学畜牧兽医专业人才培养的对策及建议。     

动物科学和动物医学专业复合应用型人才培养体系的构建、创新与实践

在动物科学和动物医学专业的教学改革中,以培养学生的实践能力、创新精神和适应社会需求为目标,通过专业课程整合、教学方法改革以及校内外实践实习基地建设等, 实现复合应用型专业技术人才培养体系的构建、创新与实践, 有效地提高2个专业的人才培养质量,得到社会各界的广泛认可。     

一种简便快速的体外点突变方法

体外点突变是研究蛋白质结构 -功能关系、基因表达、载体修饰等的重要技术之一。已报道的一些体外突变方法 [1～ 4 ] ,一般需以单链 DNA为模板 ,并要求对突变基因进行亚克隆和对单链 DNA拯救 ,技术上较复杂 ,多数需 1周以上时间。Stratagen公司研制的 Quickchange试剂盒 ,可以双链 DNA质粒为模板 ,只需 4步操作 ,在 1～ 2 d内即可完成点突变过程 [5] ,但该试剂盒价格昂贵 ,使用次数有限。我们根据 Pfu和 Dpn 等酶的特性 ,自行设计了突变反应及方法 ,对 6kb、8kb和1 4.6kb的目的质粒分别进行了点突变 ,成功地在质粒上创造了相应的酶切…     

重组逆转录病毒载体的包装

将3.7kb的LacZ基因片段克隆到含标志基因Neo的逆转录病毒载体，pLXSN与pLNCX的多克隆位点，构建了含有LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLLSN和pLNCL.在测定了G418对饥装细胞系PA317的最小致剂量后（最小致死剂量为0.3g/L），通过脂质体Lipofectin与磷酸钙2种介质，分别将2种重组逆转录病毒载体导入包装细胞系PA317进行包装，并以0.3g/L，的G418进行筛选，得到多个G418抗性克隆，经扩大培养，传代，分别得到包装pLLSN与pLNCL的2株阳性细胞，电镜下可见阳性细胞的培养上清中具有逆转录病毒形态特征的成熟病毒粒子，本0研究为运用逆转录病毒载体系统，解决转角因效率低的问题奠定了基础。     

流式细胞仪在免疫学研究中的应用

随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展,流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域,FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面,尤其是与单克隆抗体技术的结合,使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用,成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。     

多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。