云南2008～2009年H9N2亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因序列分析

禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒粒子表面抗原,是亚型划分的重要依据。从云南分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经RT-PCR分别扩增云南毒株10个HA和9个NA基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明:云南H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为95.0%～99.7%;NA基因核苷酸序列同源性为86.2%～99.6%。在进化分枝中HA基因均属于欧亚分枝的类CBJ194亚分枝,与CBJ194的核苷酸序列同源性为92.0%～99.1%,NA基因属于CK/BJ/1/94和QaHKG1/97两个分枝。云南毒株HA裂解位点结构具有低致病性病毒分子特征;HA受体结合位点143、145、198和234位氨基酸存在变异,尤其234位氨基酸全部变为L,呈现了人流感受体结合特性。NA糖基化位点61～63、86～88部分毒株存在缺失,部分毒株在143～145位出现新的糖基化位点。     

应用反转录—聚合酶链反应技术检测免疫后犬体内的犬冠状病毒

早在 8 0年代中期 ,国外就已研制出弱毒苗和灭活苗对犬进行免疫研究 [1,2 ] ,国内开展犬冠状病毒( CCV)的研究起步较晚 ,但发生 CCV性肠炎的报道很多 ,且远比国外报道的严重。 1 997年 ,胡桂学等 [3 ]利用犬胎原代细胞从一肠炎犬病料中成功分离获得 1株 CCV强毒 YS1株 ,随后我们采用静水压和 BEI灭活病毒的方法对该株强毒进行灭活 ,研制出两种新型的犬冠状病毒灭活苗 ,并对犬进行了免疫试验 ,同时我们还应用反转录 -聚合酶链反应( RT- PCR)技术对免疫后犬组织中的犬冠状病毒进行检测 ,并设立了传统的犬冠状病毒福尔马林灭活苗免疫犬…     

Ⅱ型犬腺病毒自然弱毒YCA18株的实验免疫研究

应用YCA18株第8代细胞培养物（YCA18－8）经口鼻和静脉接种犬腺(CAV)SN本＜1：2的易感犬作安全试验，结果未见任何CAV临床症状与病理解剖学改变；用不同剂量的YCA18－8分组免疫CAV易感犬，经SN抗体测定与用CAV强毒攻击试验，结果SN抗体达1：16以上的犬95％以上可获得免疫保护，最低免疫量为10^4TCID50；应用YCA18－8分别免疫母源抗体达1：4和1：8的两组试验犬，第一次免疫14d后SN抗体均未有升高，追加2－3次免疫后SN抗体才逐渐上升至1：16以上的免疫保护水平；用CAV易感犬和MDCK分别将YCA18连续传8代和20代，结果对犬仍然安全，对犬的免疫原性未见下降，最低免疫量仍为10^4TCID50；与CDV和CPV弱毒作免疫互扰试验，结果与各弱毒的单独免疫结果未见差异；将YCA18－8冰冻保存于一30℃，6个月内TCID50仍不低于10^-4/0.1ml，经加明胶－蔗糖低温真空冻干后，4℃和－30℃保存1年，TCID50均仍维持在10^-4/0.1ml以上，经YCA18－20 3次免疫的试验犬，1年后SN抗体仍在最低抗体保护值1：16以上。     

犬传染性肝炎病毒的血凝抑制抗体和中和抗体的关系

犬传染性肝炎病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｃａｎｉｎｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ＩＣＨＶ）能诱导动物机体产生中和（Ｓｅｒｕｍ　ｎｅｕｔｒｏｌｉｚａｔｉｏｎ，ＳＮ）抗体与血凝抑制（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＨＩ）抗体，本研究对８份ＩＣＨＶ免疫的犬血清同时进行了其ＳＮ抗体和ＨＩ抗体的检测，结果表明ＳＮ抗体和ＨＩ抗体具有正比线性关系ＳＮ≈８×ＨＩ，并绘制了标准曲线。由于血凝和ＨＩ试验不需应用活的试验宿主系统，而且可在３　ｈ内获得结果，操作经济简便，因此可通过测定ＨＩ抗体的效价来推算出ＳＮ抗体效价。     

犬腺病毒SY-45株不同大小蚀斑特性研究

应用蚀斑方法将SY－45毒株经过3次蚀斑纯化直到蚀斑大小相对稳定。从不同大小的蚀斑中挑选出三种蚀斑，大斑直径约3mm(简称LP）、中斑约2mm(简称MP）、小斑约1mm(简称SP）。分别在MDCK细胞上增殖并进行了三种不同大小斑毒对犬的毒力、免疫原性和在MDCK细胞上产毒量比较，以筛选最佳的疫苗株，试验结果表明用不同大小蚀斑病毒大剂量人工感染易感犬后，所有的试验犬临床症状和病理解剖学和病理组织学表现均正常；对挑选的4窝CAV HI抗体效价小于等于1：2的健康幼犬进行免疫试验，测定血清的中和抗体效价和血凝抑制抗体效价，结果表明：大斑毒的免疫原性要稍高于中斑毒，而明显高于小斑毒；不同大小蚀斑毒在MDKC细胞上产毒量差异很大，大斑毒可达10^7TCID50／mL、小斑毒达10^6TCID50／ml、小斑毒达10^4.5TCID^50/mL。综合所有试验结果表明：大斑毒株具有产毒量高、安全性好、免疫原性强的优点，是较为理想的疫苗株。     

犬腺病毒纤突蛋白基因功能区的比较分析

根据GenBank中已发表的CAV纤突基因序列，设计合成4对8条引物，用已建立的PCR方法，对犬2型腺病毒沈阳分离株第5代强毒经蚀斑克隆驯化的第60代毒弱毒（SY-V60）和犬1型腺病毒长春犬株（CCC-V6）的纤突基因进行了扩增，PCR产物经纯化后进行基因序列测定，测定结果经拼接后得到一个由1632和1629个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列，分别编码543和542个氨基酸。犬2型腺病毒（SY-V60）与犬1型腺病毒（CCC-V6）的纤突基因的同源性达到80.48%。犬2型腺病毒（SY-V60）与犬1型腺病毒（CCC-V6）纤突基因的同源性达到80.48%；根据犬的腺病毒与人2型腺病毒纤突蛋白的序列同源性比较结果，推测了犬腺病毒纤突蛋白的尾（tail)、轴（shaft)，结（knob)三个功能区的氨基酸序列，2个型之间的尾区同源性为76.9%；轴区同源性为78.59%；其结区同源性为83.24%，而同型毒株之间结和尾区同源性较高，轴区同源性较低。     

一种简便快速的体外点突变方法

体外点突变是研究蛋白质结构 -功能关系、基因表达、载体修饰等的重要技术之一。已报道的一些体外突变方法 [1～ 4 ] ,一般需以单链 DNA为模板 ,并要求对突变基因进行亚克隆和对单链 DNA拯救 ,技术上较复杂 ,多数需 1周以上时间。Stratagen公司研制的 Quickchange试剂盒 ,可以双链 DNA质粒为模板 ,只需 4步操作 ,在 1～ 2 d内即可完成点突变过程 [5] ,但该试剂盒价格昂贵 ,使用次数有限。我们根据 Pfu和 Dpn 等酶的特性 ,自行设计了突变反应及方法 ,对 6kb、8kb和1 4.6kb的目的质粒分别进行了点突变 ,成功地在质粒上创造了相应的酶切…     

一起军犬幼犬死亡原因的诊断及病原分离

为查明4份疑为犬细小病毒病的军犬幼犬的病原及其特性,为进一步的诊断、治疗及免疫奠定基础。将4份送检的犬肠道内容物过滤后分别接种猫肾细胞(F81),培养5天后,出现典型的细小病毒样细胞病变。同时提取病料的总DNA,用犬细小病毒的VP2特异性引物进行PCR扩增,PCR阳性产物克隆至p MD18-T载体测序,并与已知参考毒株序列进行比对及系统发育分析。结果分离到4株细小病毒,经VP2基因比对分型表明,4株细小病毒毒株均属CPV-2a型。     

小熊猫犬瘟热病毒感染的诊断

昆明动物园有10只小熊猫先后发病，临床症状为双相型发热，精神委顿，眼鼻流出脓性分泌物，呕吐、腹泻，全部死亡。我们对2只死亡小熊猫的血液和脏器病料进行了CDV RT—PCR检测，结果发现小熊猫所患疾病为犬瘟热(canine distemper，CD)。现报告如下。     

犬细小病毒核酸疫苗制备及免疫试验

以犬细小病毒基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增了全长VP1基因,PCR产物经纯化和NotⅠ/BamHⅠ双酶切后与同样处理的真核表达载体pIRES进行连接,转化到感受态细胞JM109中,筛选了真核重组表达质粒pIRESVP1,并进行了序列测定。对6只9月龄犬分别接种不同剂量的pIRESVP1或空载体质粒及生理盐水,8周接种1次,每次接种前采血,测定血清的血凝抑制抗体效价,第2次免疫后即可检测到较高的血清效价。在第3次接种4周后,对全部实验犬进行攻毒,攻毒后第7天及第14天时采血,测定血清的血凝抑制抗体效价。所有接种pIRESVP1疫苗的犬均能抵抗CPV强毒的攻击,而接种空载体质粒和生理盐水的对照犬则全部发病。证明所构建的核酸疫苗(pIRESVP1)能使犬免受犬细小病毒强毒的感染。