犬瘟热病毒GZ-Z株H基因原核表达载体的构建

利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

鸽痘病毒插入载体的构建

经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个NcoⅠ位点),经PCR、克隆鉴定、酶切获得质粒pGJP-5带有NcoⅠ酶切位点的P7.5基因片段,将此片段与经同样酶切的PUC19-Z连接,经酶切和PCR鉴定,筛选出正向插入的重组质粒即为鸽痘病毒插入载体。     

猪生长分化因子11的原核表达及抗体制备

本研究旨在获得猪GDF-11的特异性抗体,以便于进一步研究猪GDF-11的功能.对猪GDF-11的编码区进行了克隆、表达载体的构建和转化、原核诱导表达和纯化以及将GDF-11注射到小鼠中并分离抗体.从猪胚肾中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到猪GDF-11基因的编码区,插入pMD18-T载体中.再经限制性内切酶BarnH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,将回收的GDF-11酶切片段插入原核表达载体pGEX-4T-2中,获得重组原核表达质粒pGEX-4T-2-GDF-11.重组质粒经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导产生了65 ku的GST-GDF-11融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切,分离纯化出42 ku左右的GDF-11蛋白;然后注射小鼠,制备了多克隆抗体,其滴度最高可达1:25 600,而且特异性好,表明得到了猪GDF-11的多克隆抗体.     

牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与活性检测

参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

重组和构建了新城疫病毒融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定。结果显示,将ＮＤＶ Ｆｘ基因片段经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,插入经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉不平板法初步筛选克隆,双酶切法,核酸探针,ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后,表明插入成功且阅读框架正确。     

猪瘟病毒Erns基因的克隆及原核表达

从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,通过R-PCR对Erns基因进行cDNA扩增,获得了696 bp的片段.将该片段克隆于T-easy载体后进行序列分析,确认PCR产物为猪瘟病毒Erns基因,从阳性克隆中提取质粒,经Bam H Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切,回收产物亚克隆到pET-32a表达载体中,提取质粒后转化BL21(DE3)感受态细胞,并筛选出阳性克隆,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测出Erns基因的表达.     

水貂源犬瘟热病毒F基因真核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体PMD-18T-CDVF,用KpnI和BamHI双酶切克隆质粒PMD-18T-CDVF后,回收F基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pcDNA3.1真核表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-CDVF。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,证实成功地构建了重组质粒,从而为研究犬瘟热新型疫苗奠定了基础。     

鹅源副黏病毒融合蛋白在毕赤酵母细胞中的表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出F蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pT-F。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pT-F,回收目的基因F片段,并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-F。用PmeⅠ酶切pPICZαA-F使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中。PCR法鉴定阳性重组子,10 mL/L甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果表明,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63 ku的重组蛋白,该重组蛋白可与NA-1株鹅源副黏病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应。     

犬瘟热病毒h基因克隆测序与原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒h基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出犬瘟热病毒弱毒疫苗株的h基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经蓝白斑筛选及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定挑出阳性克隆进行序列测定,序列分析结果表明,该基因与GenBank上标准代表毒株序列完全同源;与扬州分离株、长春分离株、新疆分离株、日本分离株D85755同源性分别为90.6%、91.3%、90.5%、91%;与Onderstepoort、Convac株、美国分离株98-2666-2同源性较高,分别为97.7%、97.2%、98.1%。再将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,转化感受态E.coli BL21细胞,经IPTG诱导表达分子质量约64 ku的重组H蛋白。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因真核表达载体的构建

根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。     

牛新孢子虫NcSRS2基因腺病毒穿梭载体的构建及在293细胞中的表达

应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。     

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。     

也木勒羊抑制素α亚基基因克隆及其真核表达

为了克隆也木勒白羊抑制素α(inhibin α,INHα)亚基基因和表达其重组蛋白质,本试验采集发情期也木勒白羊卵巢组织,并从中快速抽提总RNA,以此作为模板并根据白羊INHα亚基基因编码区序列(GenBank登录号:XM_004004955.1)设计合成1对引物,经反转录扩增获得了也木勒白羊INHα亚基基因编码区全长序列.并将扩增产物克隆到表达载体(pEGFP-N1)的Scal Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间,构建重组质粒pEGFP-INHα并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,后进行鉴定、测序,证明成功构建了INHα亚基基因的真核表达载体.将也木勒白羊INHα亚基基因与人、大猩猩、牛等动物的INHα亚基基因序列进行同源性比对分析,相似度都在50%以上,说明了抑制素基因具有高度保守性.用RT-PCR和Western blotting方法验证了INHα亚基基因的真核表达载体在BHK细胞中的成功表达及蛋白表达.     

伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。     

细菌素Bacteriocin E50-52(H)基因设计 及其毕赤酵母表达载体构建

设计及合成细菌素Bacteriocin E50-52(H)基因,克隆到组成型分泌表达质粒pGAPZαA中构建重组质粒pGAPZα-Bacteriocin E(H),经PCR、测序验证正确后,电转化整合到毕赤酵母基因组,基因组PCR、测序验证结果表明成功构建了细菌素组成型重组表达载体,为在毕赤酵母中表达奠定了基础。     

梅花鹿鹿茸表皮生长因子基因原核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体pMD-18T-EGF,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切克隆质粒pMD-18T-EGF后,回收EGF基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pET32a原核表达载体中,获得重组质粒pET32a-EGF。经限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明:成功地构建了原核重组质粒。     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86SLT-ⅡeA基因的克隆与表达

为了克隆与表达致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位(SLT-ⅡeA)基因,试验以F107/86为模板,PCR扩增去掉信号肽的935 bp的SLT-ⅡeA亚单位基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ与SalⅠ位点之间并测序,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:对筛选出的阳性重组质粒pGEX-SLT-ⅡeA-4测序并与GenBank登录的M36727序列比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-SLT-ⅡeA经SDS-PAGE分析其大小为58.3 ku;Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫原性。说明试验所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白。