新城疫病毒血凝素蛋白RNA适配体的筛选及活性研究

核酸适配体与单克隆抗体相比具有更高的分辨率,能识别配体间一个基团的细微差别,且所需的结合活性位点更小。本试验通过SELEX技术,体外经过12轮筛选获得了能够与F48E9株新城疫病毒特异性结合的3个RNA适配体,命名为FHN12-45-3、FHN12-36-6和FHN12-19-9。RNA适配体的二级机构预测结果显示,所筛选获得的RNA适配体空间结构以外环、内环、发夹环及突起结构为主。特异性试验结果显示,适配体FHN12-45-3经ELISA和Dot-blot试验证实能够区分不同株的新城疫病毒。生物学活性试验结果显示,适配体FHN12-45-3能够减少4个单位的F48E9株病毒血凝效价,初步表明适配体与F48E9株病毒可能的活性作用位点在血凝素蛋白上,在鸡胚成纤维细胞培养体系中适配体FHN12-45-3能够减少84.62%的F48E9株病毒蚀斑,荧光定量RT-PCR方法检测适配体FHN12-45-3能够减少培养体系中77.73%病毒载量,表明筛选的RNA适配体在细胞水平能够有效的抑制F48E9株新城疫病毒的复制。     

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因

为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.     

蜜蜂残翼病RT-PCR快速检测方法的建立

为了建立蜜蜂残翼病病毒(Deformed wing virus,DWV)RT-PCR快速检测方法,试验采用GenBank公布的蜜蜂残翼病病毒全基因序列设计1对特异性引物,对所提取的RNA进行反转录合成cDNA后,进行聚合酶链式反应,并对这种快速检测方法的特异性和敏感性进行研究。结果表明:在约702 bp处出现目的条带,其他病原无目的条带出现,灵敏性可达1×104的模板稀释度。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。     

吉林省梅花鹿副结核病血清流行病学调查

摘 要：调查2012年吉林省梅花鹿副结核病感染现状,为吉林省今后制订梅花鹿副结核病预防控制规划提供科学依据。采集吉林省富有代表性的4个梅花鹿养殖地区的630份血清样本,用ELISA方法进行副结核病血清流行病学调查。吉林省梅花鹿血清中副结核分枝杆菌抗体检测阳性率为18.73%,其中,辽源的梅花鹿副结核病阳性率为25.00 %,为吉林省副结核病之首,而四平的梅花鹿副结核病的阳性率为11.86%,明显低于其他3个地区。通过对梅花鹿在年龄与性别方面进行统计学两两比较分析发现,仔鹿与育成鹿及成年鹿之间均存在显著差异(P<0.05),育成鹿与成年鹿二者之间没有统计学意义(P>0.05),而不同性别鹿群的副结核病阳性率差异性不显著(P>0.05)。吉林省梅花鹿副结核病流行不容乐观,提示广大饲养者及相关部门应该高度重视梅花鹿副结核病的防治工作。     

细胞表面糖链类型鉴定及其与副粘病毒结合的特异性

通过糖链检测试剂盒对Vero细胞进行细胞凝集素组织化学染色鉴定,结果显示,Vero细胞与凝集素MAA和SNA呈强阳性反应,而与凝集素GNA和PNA呈阴性反应,表明Vero细胞表面具有唾液酸α2-3连接的半乳糖和唾液酸α2-6连接的半乳糖。Vero细胞神经节苷脂提取及纯化结果显示,GD1a是主要神经节苷脂组分,同时还存在GM1、GM2和GM3。为进一步确定神经节苷脂在病毒入侵中的作用和意义,使用神经节苷脂标准品及Vero细胞神经节苷脂提取物对新城疫病毒和鹅副粘病毒分别进行红细胞吸附抑制试验,结果表明,2种病毒与不同类型神经节苷脂结合特异性上存在差异。     

黑蜂王台病毒基因组结构研究进展

<正>蜜蜂病毒被认为是主要威胁蜜蜂健康的因素之一,是引发蜜蜂蜂群大量死亡及蜂群衰竭的关键因素[1-7]。首次鉴定出蜜蜂病毒并认定其为新的感染蜜蜂的病原体是在20世纪初期。目前,已知可感染蜜蜂的病毒高达20种,其中包括18种RNA病毒,其中的某些病毒已在全球范围内广泛传播[8-10]。蜜蜂病毒能够影响蜜蜂形态、生理和行为,并与弱群及蜜蜂死亡息息相关[11]。蜜蜂黑蜂王台病是由黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)引起的一     

黑蜂王台病毒研究进展

黑蜂王台病毒(black queen cell virus,BQCV)是一种常见的蜜蜂病毒,春季和初夏高发,主要危害蜂王的幼虫和蛹,蜜蜂患病后短时间内死亡,王台壁进而变黑。黑蜂王台病毒已在世界不同蜂种间广泛传播,常以无明显症状的隐性感染方式存在于蜂群中,与蜜蜂微孢子虫联合危害表现出极强的致病性,对养蜂业造成巨大损失。作者从黑蜂王台病的病原学、流行病学、临床症状、致病过程、检测方法及防控方面对其研究进展进行综述,为进一步研究黑蜂王台病毒及其防制措施提供参考。     

慢病毒介导的RNAi靶向NDVP基因抑制其在CEF上的复制

通过研究慢病毒介导的RNA干扰靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础。①针对NDVP基因设计siRNA干扰序列,构建慢病毒（lentivirus）介导的RNAi重组载体;②携带有siRNA表达元件重组慢病毒包装及其滴度测定;③包装后重组慢病毒接种CEF细胞并接毒NDV,48h分别进行Realtime RT-PCR和NDV滴度测定,并观察细胞病变情况。结果表明,本研究针对NDVNA-1株P基因2个RNAi靶位（位于开放阅读框的641和827位）设计的RNAi641和RNAi-827,对病毒复制具很强的抑制效果,且641位的重要性大于827位．     

新城疫病毒受体在不同动物细胞上的分布比较

细胞表面的SAα2,3Gal和SAα2,6Gal2种糖链可以作为新城疫病毒(NDV)入侵靶细胞的受体,但这2种糖链在不同动物细胞上的分布和相对丰度存在差异,为明确不同动物细胞上NDV受体的分布和相对含量,分别对鸡胚成纤维细胞、鹅胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞以及Vero细胞,使用糖链检测试剂盒进行凝集素细胞原位免疫组织化学检测,FITC/PI双染色后激光共聚焦显微镜观察比较不同禽类细胞上受体分布。结果表明鸡胚成纤维细胞和Vero细胞表面同时分布有SAα2,3Gal和SAα2,6Gal2种受体,而鹅胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞表面则只分布有SAα2,3Gal受体,缺乏SAα2,6Gal受体,提示NDV受体在不同禽类细胞表面的分布存在种属差异性。