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利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒(CPV-VLPs),采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为:纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。 相似文献
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小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析 总被引:2,自引:1,他引:1
本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309-311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。 相似文献
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利用Vero-DST细胞从死亡犬、狐狸肺、脾内分离到4株犬瘟热病毒-CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF,在Vero-DST细胞上传5代没有细胞病变,5代细胞培养物经电镜、间接免疫荧光及PCR鉴定为阳性。与本实验室保存的CDV-Monkey-BJ进行基因测序,并对与致病相关的F蛋白、V蛋白进行分析,F蛋白分析5株毒具有6个潜在N-末端糖基化位点,与强毒株同源性在92%~99.7%,与疫苗株不高于93.3%,在F1亚基内有7个特有氨基酸位点,这可能与其对灵长类致病有关。V蛋白分析表明,其与强毒株同源性在94%~99.7%之间,而与疫苗株不高于93.3%,CDV-Monkey-BJ C272R突变使其Zn结合能力丧失。试验结果显示,所有分离株均为强毒株,不同宿主毒株序列存在差异,值得进一步研究。 相似文献
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本研究以豚鼠作为哺乳动物模型,评价了6株H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的复制和水平传播能力。经滴鼻接种后,检测到6株病毒中有5株病毒在豚鼠上呼吸道和下呼吸道复制,病毒滴度为0.8LogEID50/mL~3.5LogEID50/mL(或g),豚鼠在感染后第2d至第10d可排出病毒。另外一株病毒A/duck/GX/22/02则仅能在豚鼠的下呼吸道低水平复制。在传播实验中,6株病毒中只有A/duck/GX/35/01能够在豚鼠间水平传播。上述研究结果表明,豚鼠适用于作为高致病性AIV哺乳动物水平传播的模型,而且H5N1亚型AIV在哺乳动物间的水平传播能力不同。本研究为进一步研究AIV在哺乳动物间水平传播的分子机制奠定了良好的基础。 相似文献
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表达犬瘟热病毒H基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为研制安全、有效的新型犬瘟热疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV) LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗株Rockborn-20/8血凝素(H)蛋白的重组病毒rLa-CDV-H,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为犬瘟热活载体疫苗的安全性和有效性.通过免疫荧光和western blot试验证明了CDV H蛋白的正确表达;重组病毒株保持了LaSota亲本株的低致病性和高滴度鸡胚生长特性;重组病毒rLa-CDV-H接种12周龄比格犬后,可以诱导显著的CDV中和抗体反应.本研究表明重组病毒rLa-CDV-H具有作为犬瘟热重组病毒活载体疫苗的潜力. 相似文献
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为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在哺乳动物间的传播能力,本研究以豚鼠为模型评价了5株H9N2亚型AIV在豚鼠体内的复制能力和水平传播能力,并分析了5株病毒血凝素(HA)蛋白的分子特征。结果表明,5株病毒均属于CK/Beijing谱系,其中2株病毒的HA具有人样受体特征(Lys226),2株病毒具有禽样受体特征(Gln226),而A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)株在该位点的氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe226)。裂解位点分析表明,5株病毒均具有低致病性AIV特征。个别病毒的潜在糖基化位点存在增加或缺失现象。感染试验表明,5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制。并且在鼻甲骨处复制稳定,平均病毒滴度为2.01 Log EID50/mL~4.5 Log EID50/mL。传播试验表明,所有病毒株的人工接种豚鼠的鼻洗液中均能够检测到病毒,最长排毒期为接毒后第8 d,而接触组豚鼠鼻洗液中未检测到病毒。本研究表明,5株H9N2亚型AIV均属于CK/Beijing谱系,部分病毒株的HA蛋白已具备人样受体结合特征,并且关键氨基酸位点(226位)处出现新的突变。5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制并通过上呼吸道排毒,但不能在豚鼠间同群传播。 相似文献
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用F81细胞从河南送检的患有肠炎的果子狸粪便样品中分离出一株病毒,经形态学、理化学、生物学和分子病毒学实验鉴定是一株CPV-2a的突变株。此毒株在F81细胞上生长,能产生CPV感染的特征性细胞病变,细胞肿胀、变圆、破碎、脱落;病毒粒子二十面体立体对称,直径为20~24nm;无囊膜,能抵抗氯仿的处理,耐酸,耐热,但能被5-IUDR抑制。可凝集猪红细胞,不凝集鸡、豚鼠、大鼠、兔、人“O”型红细胞,能被抗CPV抗体所抑制。设计特异性细小病毒引物扩增VP2基因的两个片段,并进行测序,分析结果表明,该毒株是在CPV-2a的基础上其VP2的第297位氨基酸发生A→S突变,第300位氨基酸发生G→S突变,第301位氨基酸发生T→A突变。该毒株暂定名为PV/GZL/H/1/02。该病毒能感染犬。 相似文献
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应用致敏SPA菌体提高CAV/CPV PCR检出率的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为消除粪便等病料中的PCR干扰物质 ,提高犬腺病毒与细小病毒 (CAV CPV)联合PCR检出率。根据免疫吸附的原理 ,应用CAV CPV高免血清致敏含A蛋白的金黄色葡萄球菌 ,制成致敏SPA菌体免疫吸附剂 ;以此免疫吸附提取粪便等病料中的CAV/CPV ,然后直接或经 3 5mol/LMgCl2 将所吸附病毒洗脱后再做PCR。结果 8份经电镜负染或HA/HI试验验证为阳性的粪便样品 ,如此处理后进行PCR检测 ,结果均为阳性 ;而直接取粪便离心后用上清进行PCR检测 ,结果均为阴性。表明该法可有效去除待检样品中的PCR干扰物质 ,提高PCR的检出率。 相似文献
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通过病毒分离鉴定和基因检测首次发现虎流感 总被引:21,自引:1,他引:20
应用F81猫肾传代细胞,从高热、拒食和间有神经症状的死亡率病科中分离获得1株病毒,经形态学、理化学、生物学和血清学系统鉴定,证明为流感病毒。采用流感病毒核蛋白基因引物,对分离病毒及该虎病科进行RT-PCR扩增和序列分析,结果从分离病毒和虎病科中均扩增出与理论值大小相符的464bp基因片段;其序列与A、B、C3型流感病毒相比较,同源性分别为84.9%、35.0%、24.8%。由此说明,所分离病毒为A型流感病毒,命名为/蘧/哈尔滨(中国)/01/2002。用此分离病毒静脉接种于3月龄家猫3号,均出现与病虎相似的临床症状,其中1号耐过,2只死亡。死亡猫剖检变化与死虎相似,主要是呈肺炎病变,并可从病科中回收到所接种病毒。从此分离病毒为HA抗原,进行虎与猫血清的HI抗体检测,结果康复虎血清比其病初血清、康复猫血清比其接种前血清HI抗体均增高4倍以上,表明该病毒具有致病性,是引起该虎与试验猫发病甚至死亡的病原。 相似文献