猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体检测ELISA在中和抗体评估中潜在应用的研究

为评估猪群血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体水平,本研究以原核表达的重组HP-PRRSV GP5蛋白为包被抗原,通过对反应条件进行优化,建立了检测GP5抗体的间接ELISA(r GP5-ELISA)。结果显示该方法与猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、细小病毒、日本乙型脑炎病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。重复性试验结果显示,组内组间变异系数均小于5.3%。应用建立的r GP5-ELISA方法和IDEXX-ELISA对288份临床血清样品进行检测,结果显示两种方法具有较低的相关性(R=0.831)。中和试验(SN)结果显示,r GP5-ELISA检出阳性血清的中和效价显著高于IDEXX-ELISA(p0.01)。Western blot复检r GP5-ELISA检测呈阴性的65份猪血清样品,其中58份呈阴性、7份为阳性;而IDEXX-ELISA检测则该65份血清全部呈阳性。对比SN和western blot试验,r GP5-ELISA比商品化IDEXX-ELISA具有更高的SN抗体符合率,因而其检测结果能够更好地反映猪群血清中和抗体水平。本研究建立的方法可以用于大规模猪群PRRSV中和抗体水平评估,并为PRRS流行病学调查提供了技术支持。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在疫苗上的应用研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响养猪业发展的主要病原。GP5蛋白是PRRSV的主要糖蛋白,是中和抗体的主要靶标。因此,GP5蛋白的研究在PRRSV感染的诊断和新型基因工程疫苗的研发上具有重要意义。近年来,对于GP5蛋白的研究取得了重要的进展,本文就GP5蛋白的特性、功能和应用等方面进行综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征的血清学调查与病原核酸检测

为了解贵州省猪群中猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行情况,并对临床发生的疑似PRRS疫情作出确定性诊断,本试验采用PRRS酶联免疫诊断试剂盒对非免疫猪群和免疫猪群的1 254头份血清样本进行抗体检测,采用RT-PCR方法对疑似病例样本进行鉴定。结果显示,非免疫健康猪群PRRS抗体阳性率为5.90%;发病猪群阳性率为29.16%;免疫猪群抗体阳性率为59.45%;利用针对PRRSV GP5基因的引物对疑似病例样本进行了PCR扩增,将所得序列与GenBank收录的7株PRRSV GP5基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析,结果与欧洲株(LV)的同源性分别为50.0%和46.7%,与美洲株(VR2332)的同源性分别为88.7%和89.9%,而与国内其它毒株的同源性为93.9%~99.1%和91.5%~99.5%;系统进化分析显示贵州分离株均为美洲型。PRRSV Nsp2变异毒株特异性PCR诊断试剂盒鉴定结果显示,疑似病例样本均扩增出特异性条带,表明流行在贵州省猪群中的PRRSV毒株均为变异毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大.GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体.因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最佳候选基因.近年来对GP5蛋白的研究取得了重要的进展,现就GP5蛋白的特征、免疫作用及疫苗等方面做一综述.     

扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

针对扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus,ZEBOV)的糖蛋白(GP)基因(158~368aa)设计引物,将PCR扩增产物克隆至原核表达载体pET30a(+),在宿主菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达。对诱导条件进行优化,纯化后的蛋白通过SDS-PAGE和Western blot鉴定正确后免疫BALB/c小鼠,二免后分离小鼠血清,制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,埃博拉病毒GP在大肠杆菌中以包涵体的形式成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导6h。经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体可以识别重组杆状病毒rBacmid-GP。本研究成功表达并纯化埃博拉病毒GP,制备鼠多克隆抗体,为建立基于ZEBOV GP的检测方法和相关研究奠定了基础。     

PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后特异性抗体的中和活性分析

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体的中和活性,研究以原核表达的重组蛋白GP5和M为抗原分别与霍乱毒素B亚基(CTB)佐剂按10∶1的比例混合制备成CTB黏膜佐剂疫苗,滴鼻免疫小鼠,于首次免疫后0,7,14,21,28,35,42 d收集唾液和血清样品,利用间接ELISA方法分别检测免疫小鼠唾液中特异性抗体IgA,结果均于28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶2;血清中特异性抗体IgG分别于21,28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶800。通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法分别检测唾液中特异性抗体IgA和血清中特异性抗体IgG中和滴度均1∶2,结果表明PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体未达到免疫保护作用的中和抗体水平。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSV HB-3株GP5、M和N基因,通过Linker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因一起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体(1∶4),随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高(1∶32)。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测感染猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或PRRSV弱毒疫苗免疫后猪群体内抗体水平的方法,本研究以PRRSV GP5基因的原核表达蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法。利用RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,将其克隆于p GEX-6p-1中构建原核重组表达载体p GEX-6P-GP5,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以梯度尿素法对表达蛋白纯化后,以其为包被抗原,利用方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了GP5蛋白的最佳包被浓度是150 ng/孔,被检血清的最佳稀释倍数为80倍。试验结果显示,该检测方法的特异性、敏感性、重复性很强。从山东各地采集203份猪血清样品进行检测,结果显示该检测方法与商品化PRRSV抗体检测试剂盒(法国LSI)检测结果的符合率为96.5%。本研究建立的间接ELISA方法,为猪群体内PRRSV抗体水平的检测提供了重要的检测手段,在疫苗免疫效果的评价方面有着广泛的应用。     

不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc-145细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRR...     

融合域点突变的埃博拉病毒GP蛋白重组新城疫病毒的构建与免疫评价

扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)的感染会引起人类以严重出血和发热为主要症状的传染病,死亡率高达90%,对公共卫生构成严重威胁。EBOV囊膜蛋白(GP)是病毒主要的免疫原性蛋白。本团队前期的研究表明,以新城疫病毒(NDV)为载体构建表达EBOV GP蛋白的重组病毒rLa-EBOVGP改变了 NDV的侵入方式。为了研制出安全性更高的埃博拉候选疫苗株,本研究将EBOV GP蛋白的融合域I~(532)突变为R后插入NDV LaSota疫苗株(rLa)基因组中,通过反向遗传学操作拯救表达EBOV GP(I~(532)R)蛋白的重组NDV,并将经PCR鉴定正确的重组病毒在鸡胚中连续传代检测了其的体外遗传稳定性。RT-PCR鉴定结果显示,EBOV突变的GP(I~(532)R)蛋白基因正确插入了 NDV基因组中,表明获得了重组病毒rLa-EBOVGP (I~(532)R);在鸡胚中连续传20代后,经RT-PCR扩增EBOV GP(I~(532)R)基因后经测序鉴定,结果显示rLa-EBOVGP(I~(532)R)能够保持良好的遗传稳定性。利用蔗糖梯度超速离心法纯化rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I~(532)R)病毒,分别进行western blot检测。结果显示,EBOV GP和GP (I~(532)R)蛋白均能够正确表达;将rLa、rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP (I~(532)R)分别感染BHK-21细胞后,利用激光共聚焦试验分析EBOV GP(I~(532)R)的表达和定位,结果显示GP(I~(532)R)能够表达且位于BHK-21细胞的细胞膜上;对纯化病毒利用免疫电镜观察病毒颗粒,结果可见rLa-EBOVGP (I~(532)R)与亲本病毒rLa结构特征相似,且GP (I~(532)R)蛋白能够嵌合在重组病毒粒子表面;生长动力学试验结果表明,rLa-EBOVGP(I~(532)R)与亲本株rLa在鸡胚中的生长特性基本一致,且能够稳定增殖;分别将重组病毒rLa-EBOVGP和rLa-EBOVGP(I~(532)R)经肌肉注射和滴鼻两种途径免疫小鼠,经稀释血清固定病毒的方法分别检测各组小鼠针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。结果显示rLa-EBOVGP (I~(532)R)能够诱导小鼠产生较高的针对NDV和EBOV GP蛋白的中和抗体。以上结果表明rLa-EBOVGP(I~(532)R)具有作为防控EBOV感染的储备性候选疫苗株的潜力。本研究为进一步研究GP(I~(532)R)的生物学功能奠定了基础。     

螢光抗体技术在猪瘟诊断中的应用

现在日本采用萤光抗体法诊断猪瘟。萤光抗体技术是将抗体(或抗原)标记上萤光色素,与相应抗原(或抗体)结合后,在萤光显微镜下,呈萤光现象的一种特异免疫萤光反应方法。诊断猪有三种作法。 1.组织切片法:从病猪采取扁桃体的薄     

鸡传染性喉气管炎中和试验方法的研究

关于鸡传染性喉气管炎(ILT)的诊断,通常系采用临床观察、鸡胚接种、荧光抗体及包涵体等检查方法,这些方法应用于典型发病鸡虽不难达到确诊的目的,但对确诊临床表现不典型或感染耐过的鸡就较为困难。用琼扩方法诊断此病虽较快速简单,但检出率不高;而中和试验法具有高度的敏感性,但操作方法复杂,在一般条件下难以广泛应用。     

抗PRRSVGP5和M蛋白独特型抗体替代抗原诱导机体产生中和抗体的研究

制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗独特型抗体(Ab2),探讨Ab2替代抗原对机体免疫调节作用的研究。用纯化的PRRSV-GP5(GP5-Ab1)蛋白和抗PRRSV-M(M-Ab1)蛋白单抗免疫大白兔,当免疫血清琼扩效价达1:16以上,加强免疫后心脏采血分离血清,分别纯化兔抗PRRSV-GP5IgG(GP5-Ab2)和抗PRRSV-MIgG(M-Ab2)血清,分别用GP5-Ab2、M-Ab2以及GP5-Ab2与M-Ab2混合型三种分别免疫未免PRRS疫苗的小猪,同时设PRRS弱毒苗、灭活苗和空白组作对照,免疫后21d采集猪血清,间接ELISA检测免疫Ab2和PRRS疫苗的猪血清全为阳性,空白组仍然为阴性。经细胞中和试验证明免疫Ab2及PRRS疫苗的猪血清都具有中和抗体,说明Ab2在体内具有替代PRRSV的作用诱导机体产生具有中和效应的中和抗体,从而起到保护机体免受PRRSV的感染作用,为猪繁殖与呼吸综合征病新型疫苗的研究提供了新的思路。     

应用荧光抗体法诊断猪瘟的研究 Ⅰ 对人工感染猪瘟猪扁桃体冰冻切片荧光抗体法诊断的研究

Solorzand(1962)首先提出用荧光抗体法诊断猪瘟,认为此法不仅敏感,而且特异性亦高。1963年Stair,1964年Aikenct等应用组织切片和压片做了猪瘟荧光抗体法的研究。1963年Mengeling等应用猪肾继代细胞(РК—15)进行了猪瘟荧光抗体的研究。1969年须原贤治等报导了应用扁桃体冰冻切片荧光抗体染包诊断猪瘟的方法。目前,美、日、法、荷等国均已广泛采用荧光抗体法做为常规的猪瘟诊断方法。荧光抗体     

甘草多糖及其脂质体增强免疫活性的比较

提取甘草多糖(GP),制备甘草多糖脂质体(GPL),比较了GPL和GP的免疫增强活性。体外试验,将安全浓度范围内5个浓度的GPL和GP分别加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化;体内试验,雏鸡用新城疫疫苗免疫的同时,分别注射高、中、低剂量的GPL和GP,测定免疫后不同时间点外周血淋巴细胞增殖和抗体效价的变化。结果显示,GPL和GP在合适的浓度均能单独或协同PHA、LPS显著刺激淋巴细胞增殖,GPL的作用显著优于GP;在体内,GPL高、中剂量能够显著促进淋巴细胞增殖,增强抗体效价,作用显著强于GP(P0.05),结果表明,脂质体能显著提高甘草多糖的免疫增强活性。     

PRRSV GP2a胞外区的原核表达及免疫原性分析

为获得有活性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)BJ-4株GP2a胞外区蛋白,以真核质粒pcDNA3.1-ORF2为模板,设计针对GP2a胞外区(41-208aa)的特异性引物,通过PCR等方法,获得重组表达质粒pET-32a-eORF2,转化宿主菌Rosetta(DE3),并用1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。SDS-PAGE结果表明,重组的GP2a胞外区蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 000;将包涵体纯化、复性后,以50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,三免后,抗体效价达1∶102 400;这表明GP2a胞外区成功表达,且具有良好的免疫原性。     

检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体的两种ELISA方法的比较及其应用

采用检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)两种不同目标蛋白抗体的间接ELISA方法对来自10个规模猪场216份血清进行检测,结果显示,包被抗原分别为核蛋白(Nucleoprotein,N)和以GP5蛋白为主的膜蛋白(membrane pro-teins,G)的两种方法检测阳性率分别为83.8%和81.9%,符合率为92.6%,Kappa值为0.74,表明两种检测方法的检测结果在给定的临界点条件下抗体检测结果具有良好的一致性。通过数据标准化,调整阴阳性判定的临界点,发现两种检测方法所得出的阳性率变化趋势相似,但检测膜蛋白的G-ELISA抗体阳性率其降幅显著高于检测核蛋白的N-ELISA。本试验初步阐明了检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体的两种间接ELISA方法的特点,为科学使用提供依据。     

牛白血病单价抗体的制备

用各种方案高免实验室动物制备的牛白血病诊断血清,其免疫球蛋白是非常不纯的,而用免疫吸附法来制备纯抗体和纯抗原需要的许多昂贵的不溶性载体都是很短缺和难以得到的。苏联维捷布斯克兽医研究所用牛红细胞作为载体(红细胞免疫吸附剂)制备牛白血病单价抗体。方法如下: