牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤cDNA文库的构建与鉴定

以牛蛙皮肤组织为材料获得总RNA,用偶联Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含Sfi Ⅰ酶切位点的CDSⅢ引物在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1链,以含Sfi Ⅰ酶切位点的CDSⅢ引物和SMART引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经Sfi Ⅰ酶切,通过T4DNA连接酶连接到经过相同酶切的λTripIEx2载体,体外包装后转染E.coli XLI-Blue 宿主菌,进行滴度测试和文库扩增.结果构建的牛蛙皮肤cDNA 文库原始库容量为1.42×106 PFU/mL,插入片段长度在0.5～1.5 kb,重组率为89.5%,扩增后的文库滴度为1.35×109 PFU/mL,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析.     

应用LD-PCR法构建大片吸虫成虫cDNA表达文库

为构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,用Trizol试剂提取大片吸虫成虫总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用LD-PCR扩增方法,合成双链cDNA。用SfiⅠ内切酶修饰此双链cDNA,使形成两端分别带有SfiⅠA和SfiⅠB的黏性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有SfiⅠA和SfiⅠB末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA表达文库。经测定,库容量为1.08×106PFU/mL,重组率为96.6%。扩增后的文库滴度为2.41×109PFU/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。这些结果表明已成功构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,适合进一步筛选大片吸虫新基因。     

犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库的构建

试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶消化双链cDNA末端接头,使双链cDNA 2端含有EcoRⅠ和Hind Ⅲ黏性末端。所有处理后的双链cDNA,经Mini Column 纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接带有EcoRⅠ和Hind Ⅲ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。经测定未扩增文库的滴度为1.3×10⁷ PFU/mL,重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.6×10¹⁰ PFU/mL。随机挑取100个噬菌斑进行PCR鉴定,95%的插入片段大于400 bp。结果表明成功构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。     

华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

构建华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础,也为进一步研究华支睾吸虫后囊蚴感染宿主的信号传导机制、探究其致病机理提供新的起点。从中国东北疫区（镇赉县）麦穗鱼肉里分离收集华支睾吸虫囊蚴,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,加EcoRⅠ接头,经XhoⅠ酶切,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接,Gigapack III Gold包装蛋白体外包装,构建华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库。结果表明,构建的华支睾囊蚴cDNA表达文库的库容量为9.15×10⁵ PFU,重组率为99.5%,扩增后文库滴度为1.6×10¹⁰PFU/mL。成功构建了一高质量的华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库。     

东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础.用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA.在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端.用Mini Column纯化、收集300 bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库.经测定,库容量为1.3×107 PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011 PFU/mL.对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200 bp～1 000 bp,其中有95.5%的插入片段大于300 bp.用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%.     

大片吸虫成虫cDNA文库的构建和组织蛋白酶L1基因的克隆

目的大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1(Fasciola gigantica Cathepsin L1,FgCL1)基因的克隆。方法提取大片吸虫成虫总RNA,运用SMART技术构建大片吸虫cDNA文库。根据文献设计并合成PCR引物,从上述文库中克隆大片吸虫FgCL1基因,定向克隆至原核表达载体pET28a中。结果文库容量为2.08×106pfu/mL,重组率为98%。扩增后的文库滴度为6.23×109 pfu/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。应用两个已知基因(FgCL1 FgGST)从文库中成功钓取到相应的全长基因。将含有FgCL1的阳性克隆测序,用Genebank Blast进行序列比较,证实为FgCL1基因。结论成功构建了cDNA文库,提供筛选大片吸虫基因资源;从该文库中克隆出FgCL1,为进一步表达该基因,研制诊断试剂盒创造了条件。     

日本血吸虫7d童虫cDNA文库构建及免疫筛选

为了从7 d童虫cDNA文库筛选出童虫发育阶段特异性表达抗原基因。本研究首先构建了日本血吸虫7 d童虫cDNA文库,其次再采用日本吸血虫感染血清进行筛选。结果显示:建立的文库插入片段为0.5~3.0 kb,文库重组率为98%,初始文库滴度为2.4×10~6 pfu/mL,扩增后滴度为1.6×10~9 pfu/mL,利用感染日本血吸虫10 d和42 d的小鼠血清免疫筛选该文库,初筛和复筛后获得17条有效EST序列,其编码7个基因,分别为复制蛋白(2 ESTs)、肝再生增强因子(3 ESTs)、血小板活化因子(6 ESTs)、钙调理蛋白基因(3 EST)、丝束蛋白(1 ESTs)、核糖体RNA(1 EST)和还原型辅酶脱氢酶基因(1 EST)。该研究结果对今后探讨血吸虫的生长发育机制及筛选血吸虫早期诊断抗原具有重要意义。     

鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA表达文库的构建

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105 CFU/mL、1×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL,文库总容量分别为1.2×106CFU、1.2×106CFU、1.5×106CFU,平均插入片段分别为1 270 bp、1 190 bp和1 120 bp,阳性重组率均为100%.将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒,取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库,经测定平均滴度为1×105CFU/mL,文库总容量为1.2×106CFU,平均插入片段为1 017 bp,阳性重组率为100%.结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和较大的库容量,为进一步筛选鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)在法氏囊B淋巴细胞中的受体及研究细胞嗜性奠定了基础.     

青海血蜱cDNA表达文库的构建

在无RNA酶污染的环境下摘取半饱血青海血蜱唾液腺、马氏管和卵巢等器官,从中提取RNA,进而纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成青海血蜱的cDNA表达文库。经测定,所构建青海血蜱cDNA文库的库容量约为2×106PFU/mL,重组率为100%,扩增后文库的滴度为8×109PFU/mL。通过对该文库的免疫学筛选,获得一个编码青海血蜱肌球蛋白碱性轻链的全长cDNA序列。所有结果显示,青海血蜱cDNA表达文库已成功构建。     

奶牛β-干扰素在大肠杆菌中高效表达和生物活性分析

提取经植物血凝素诱导培养的中国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛β-干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,扩增片段为奶牛β-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的40%。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛β-干扰素抗病毒活性分别约3.16×105U/mL,7.5×104U/mL。结果表明,重组奶牛β-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。本研究为研制和开发重组奶牛β-干扰素类生物制品研发奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌诱发建立乳房炎小鼠病理模型

为了建立小鼠乳房炎模型,将30只昆明小鼠随机分成3组,分别经第4对乳腺注入50μL的生理盐水、1.0×105CFU/mL和2.0×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌,观察乳腺组织的外形和组织切片的变化;结果表明,注菌后24 h,小鼠出现明显的临床症状,乳腺出现不同程度的炎性症状,组织病理学显示腺泡腔内有大量嗜中性粒细胞浸润,泡腔间隔增宽。说明金黄色葡萄球菌能够诱发试验性乳房炎。     

家猪Fosmid基因组文库的构建

本研究采用蛋白酶K和苯酚抽提法提取基因组DNA，通过物理方法随机剪切DNA，经T₄DNA聚合酶和T₄多聚核苷酸激酶末端修饰，琼脂糖凝胶电泳回收大小为25~40 kb的片段，与pCC1FOS载体连接，噬菌体包装蛋白体外包装，转染大肠杆菌EPI300，构建了家猪Fosmid基因组文库。文库容量为8.50×10⁹CFU/ml，平均插入片段大小约25 kb，用家猪MC1卫星DNA做探针对文库进行初步筛选，获得含该卫星DNA的阳性克隆，该文库的构建为进一步筛选并研究猪卫星DNA序列奠定了基础。     

单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性研究及单克隆抗体的制备

原核表达单增李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,检测ActA的免疫原性,以表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,并对单抗的亚型、效价、亲合力及特异性进行测定。结果表明,成功表达了ActA蛋白;表达蛋白诱导了特异性的细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫原性;共获得4株抗Lm ActA单克隆抗体。其中3G6、4E10和2B9为IgG1亚类;腹水抗体效价,3G6和4E10为1∶64000,2B9为1∶32000;3G6、4E10和2B9的亲和常数分别为6.62×107M-1、5.67×107M-1和7.15×106M-1;3G6、2B4和4E10为Lm特异性单抗,2B9为致病性李斯特菌特异性单抗。所制备的单抗可用于Lm检测方法的建立。     

华支睾吸虫成虫cDNA表达文库的构建与筛选

为了获得华支睾吸虫成虫期强反应原性抗原基因,首先利用λZAP栽体构建华支睾吸虫成虫cDNA表达文库:即从我国东北疫区(镇赉县)家犬胆管内分离收集华支睾吸虫成虫,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与栽体λZAP Express连接,体外包装后成功获得我国东北疫区华支睾吸虫成虫cDNA表达文库.文库容量为1.5×106pfu,重组率为99%,插入片段长度在0.4～2.0 kb之阀,扩增文库的滴度为1.5×1010pfu/mL.然后利用免疫学方法对该cDNA表达文库进行筛选:以自然感染华支睾吸虫的人血清为抗体探针,从2.0×105个重组噬菌体筛选强反应原性抗原基因,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析.共获得41个阳性克隆,测序结果分析表明,这些cDNAs根据其编码的蛋白可分为以下几种,即与来自华支睾吸虫的甘氨酸-2、脯氨酸-2及Cs44抗原高同源的基因及分别与来自Nematostella vectensis的未知蛋白、转录延伸因子及果蝇CG3446基因编码蛋白较低同源性的基因.本研究结果为进一步对华支睾吸虫抗原的生物学特性研究及应用奠定了理论基础和实验依据.     

家蚕微孢子虫cDNA文库的构建及部分EST同源性分析

以成熟的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)为实验材料 ,以λTriplEx2为载体 ,构建了滴度为 1 86× 10 6pfu/mL ,插入片段平均在 5 0 0bp以上的较高质量的家蚕微孢子虫cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取 180个克隆进行EST测序 ,得到了 130个有效序列。经BLASTn、BLASTx同源性分析后发现 ,7个ESTs编码基因在氨基酸水平上与脑孢虫有较高的同源性 ,推定为家蚕微孢子虫基因 (putativegene) ,同时获得了 2 7个未知序列。     

羊草叶片cDNA文库的构建及部分表达序列标签的分析

采用SMART技术,以品质优良羊草“吉生一号”叶片为材料,构建了高质量cDNA文库。原始文库滴度达到10⁶cfu/mL,扩增文库滴度接近10¹¹cfu/mL。随机抽样检查结果表明,插入片断大小在0.5~3.0kb,主要集中在1kb左右,其中检测到插入片断大于1kb的占70%,最大达到2.5kb,其重组率达到98%。同时在扩增文库中检测到了羊草维生素E合成途径中的关键酶基因α-生育酚环化酶(TC)及γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的特异信号,挑选307个筛选出了285条EST序列,将得到的117条非重复序列与GenBank中已知序列比对,获得了如3-磷酸甘油醛脱氢酶、光系统Ⅱ蛋白D1、翻译起始因子蛋白、翻译延生因子蛋白、RNaseS-likeproteinprecursor蛋白等基因。羊草高质量的cDNA文库的构建为进一步从分子水平研究羊草及开发利用这一基因资源提供了条件。