小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达与间接ELISA检测方法的建立

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,也是诊断小反刍兽疫的主要靶蛋白。为获得高效表达的可溶性N蛋白,并建立基于N蛋白的小反刍兽疫的间接ELISA检测方法,通过优化密码子、优化表达条件等条件探索,在大肠埃希菌表达系统中获得了高效表达的可溶性N蛋白,进一步基于N蛋白建立了间接ELISA检测方法,该方法对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数均低于9%,具有良好的重复性。对480份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,符合率达到98.33%。本研究为进一步开发成熟的小反刍兽疫抗体检测试剂盒奠定了基础。     

重组N蛋白抗原检测PPRV抗体ELISA的研究——试剂盒阴阳性临界值的测定及其与OIE参考实验室试剂盒的比较

对临床上采集的244份不同背景的羊血清样本,用纯化的重组N蛋白为包被抗原建立的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的间接ELISA进行检测,运用统计学方法摸清了检测结果的分布规律,并同时用OIE参考实验室抗体检测试剂盒进行检测,结果表明,两种检测方法的符合率为91.73%。利用TG-ROC软件分析了ELISA抗体检测临界值,该试剂盒与国外试剂盒相比,其相对特异性和敏感性分别为98.6%和85.4%。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白抗原性与特异性的比较

为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。     

双抗体夹心ELISA检测小反刍兽疫病毒抗原方法的建立及病原流行病学调查

应用表达纯化的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)N蛋白制备的多克隆抗体,建立了检测PPRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省和内蒙古地区羊群感染PPRV进行了调查。方阵法确定了抗PPRV兔源IgG作为捕获抗体的包被量为0.2μg,酶标抗体的最佳稀释度为1∶1 000。对大量小反刍兽疫阴性粪便样品进行检测及统计学处理,确定了双抗体夹心ELISA检测PPRV的判定标准,即被检粪便样品D490≥0.221,判定为阳性。特异性、敏感性等试验结果表明,建立的检测PPRV抗原方法具有特异、敏感和快速等优点。与RT-PCR方法相比,该方法省时省力、简单快速。应用建立的检测PPRV抗原的双抗体夹心ELISA对吉林省和内蒙古不同地区的羊粪样进行检测,发现羊群均存在程度不同的PPRV隐性感染。本研究在国内首次揭示出临床健康羊群携带PPRV,为今后小反刍兽疫的诊断与防控提供了新的流行病学理论依据。     

小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒N蛋白阻断ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯化后免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选针对PPRV N蛋白的阳性单克隆细胞株,获得了具有阻断效果的单克隆抗体1B11株。经免疫荧光方法鉴定该单克隆抗体与PPRV Nigeria 75/1毒株发生特异性反应。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记1B11抗体作为阻断抗体,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。经优化反应条件,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,阻断抗体的最佳浓度为1μg/mL,待检血清1∶2稀释反应1 h,底物反应时间为10 min,阴阳性检测临界值为阻断率为58.5%。特异性试验证明该方法与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)等阳性血清不发生交叉反应。通过对234份血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒符合率为91%(213/234)。由此表明,建立的阻断ELISA方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了基础。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的表达与ELISA检测方法的建立

通过对下载的16株小反刍兽疫病毒（PPRV）N基因片段进行序列分析,合成了PPRV N基因。用NP1和NP2引物扩增。纯化的PPRV N基因在T4DNA连接酶的作用下,和PET32-a载体进行连接反应构建重组质粒pET-a-PPRV-N。经诱导表达和纯化后,得到了大量的PPRV N蛋白。用PPRV N蛋白制备免疫血清,经国际标准血清标化后作为参考阳性血清,同时以PPRV N蛋白为抗原建立间接ELISA（I-ELISA）方法。对山东省的467份羊血清检测,使用S/P（样品值/阳性值）平均值加3倍标准差的方法,计算出其临界点为0.28。应用间接ELISA和针对H蛋白的单抗为基础的C-ELISA检测来自于疫区的69份血清,结果两者的符合率为79.7%。     

小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。     

小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内代谢消长规律的研究

为研究小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内的代谢消长规律,试验通过建立小反刍兽疫N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法、H蛋白阻断ELISA抗体检测方法与血清中和抗体试验方法,分别检测了羊免疫疫苗后体内N蛋白抗体与H蛋白抗体在每个免疫阶段的代谢消长变化。结果表明:羊免疫小反刍兽疫疫苗后,血清内的N蛋白抗体与H蛋白抗体在6~8周时血清抗体效价较高,对应的羊体内中和抗体效价为1∶512,且效价至少可以持续到10周以上,2种抗体具有一定消长代谢规律的相关性。该研究结果也为以N抗原与H抗原为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法、竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA检测方法奠定了一定的理论依据。     

Induction of protective immune response against both PPRV and FMDV by a novel recombinant PPRV expressing FMDV VP1

Peste des petits ruminants (PPR) and foot-and-mouth disease (FMD) are both highly contagious diseases of small domestic and wild ruminants caused by the PPR virus (PPRV) and the FMD virus (FMDV). In this study, a recombinant PPRV expressing the FMDV VP1 gene (rPPRV/VP1) was generated and FMDV VP1 expression did not impair replication of the recombinant virus in vitro and immunogenicity in inducing neutralizing antibody against PPR in goats. Vaccination with one dose of rPPRV/VP1 induced FMDV neutralizing antibody in goats and protected them from challenge with virulent FMDV. Our results suggest that the recombinant PPRV expressing the FMDV VP1 protein is a potential dual live vectored vaccine against PPRV and FMDV.     

小反刍兽疫H蛋白主要抗原表位的原核表达

目的表达小反刍兽疫病毒H蛋白的主要抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫病毒H基因的主要抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的H基因的主要抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经不同浓度的IPTG诱导表达PPRVH基因的主要抗原位点;用SDS-PAGE和Western-blotting分析所有蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-H66-249和PET-28b-H281-550酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫H蛋白基因完全一致,其大小分别为569bp和831bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测,证明所有的蛋白均得到表达。结论成功表达了PPRVH基因的主要抗原蛋白,为日后的检测与预防工作奠定了基础。     

新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒分子特征

为了解新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)的分子特征,根据GenBank公布的PPRV基因组序列设计并合成引物,采用RT-PCR方法和基因测序技术获得病毒全基因序列,应用分子生物学分析软件,对分离的PPRV毒株进行序列分析。结果显示,本次分离的PPRV毒株(China/XJAKS/2017)属于基因IV型,基因组全长15 954 nt,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白;在系统进化上,与国内新疆分离株China/XJBZ/2015、China/XJYL/2013同源率分别高达99.0%、99.6%,与国外的巴基斯坦和塔吉克斯坦分离株亲缘关系最近。结果表明,PPRV已经在家养动物与野生动物之间传播。结果提示,PPRV传入野生动物群为我国消除PPR带来极大困难,需加强我国边疆地区PPR免疫隔离带建设,并对野生动物PPRV分子流行病学特点进行追踪监测。     

表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定.免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRV F蛋白.以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28 d以相同剂量进行二次免疫.分别于一免后21 d和二免后14 d采血后分离血清进行病毒中和试验.结果表明,一免后21 d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1:40、≥1:80、≥1:80,PPRV中和抗体效价依次别为1:20、1:40、1:20,全部阳转;二免后14 d,GPV中和抗体效价≥1:80,PPRV中和抗体效价依次为1:20、1:80、1:40.本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础.     

PPR与RP病毒N蛋白片段的克隆表达与纯化

目的选取PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的片段进行重组表达。方法对PPRV和RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa蛋白片段基因进行大肠杆菌偏爱密码子优化后人工合成,利用分子生物学技术,将目的基因分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3),诱导表达并纯化PPRV与RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa片段。结果得到了分子量分别约17.8kD、20.6kD的各两段融合蛋白。结论本研究成功表达了PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的51-175aa和376-525aa蛋白片段,为制备能区别PPR和RP病毒的特异性单抗提供了抗原。     

内蒙古乌兰浩特某羊群暴发小反刍兽疫的诊断

2016年,内蒙古乌兰浩特某羊群暴发临床上以发热、流涎、口腔黏膜严重溃疡、呼吸道症状严重为特征的疫病,发病率为34.30%,死亡率为49.60%。本研究通过流行病学调查、临床与病理学检查及分子生物学检测等方法,确定该羊群暴发的疫病为小反刍兽疫(PPR)。应用PCR技术,扩增分离毒株NH13的N蛋白基因序列并进行序列测定与比对分析,结果显示NH13毒株与国内外新近报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)毒株的同源性高达96.4%,表明引起该次暴发流行的PPRV NH13毒株与近几年国内不同地域暴发的PPRV可能源于同一病毒。本研究结果为PPR的防控提供分子流行病学理论依据。     

小反刍兽疫病毒芯片式数字PCR检测方法的建立及应用

为建立一种准确、快速、敏感性更高的小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）检测方法,建立了一种芯片式数字PCR（cdPCR）检测方法。根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75 /1疫苗株N基因序列设计1对引物,PCR扩增大小为166 bp片段,构建pMDTM18-N标准质粒并优化反应条件,建立了PPRV N基因cdPCR检测方法,并与实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果显示：当质粒标准品浓度在1.22×（105~102）copies/μL范围时,cdPCR检测方法比普通RT-PCR灵敏度高1 000倍,且稳定性好,特异性强;当标准品浓度在1.22×（105~10-3）copies/μL范围时,cdPCR与RT-qPCR相比具有相同的特异性,但灵敏性比RT-qPCR高100倍;与RT-qPCR 测定结果（13.29±6.74）copies/μL相比,cdPCR的最低检测限更低,约为（0.44±0.14）copies/μL;cdPCR对47份临床样本的PPRV核酸阳性检出率（25.5%）高于RT-qPCR（17.0%）。结果表明,建立的cdPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为预防PPR早期流行提供了一种快速有效的诊断和定量检测方法。     

厦门市同安区羊群小反刍兽疫传入风险评估

通过对同安区羊群养殖、调运和检疫监管等情况的摸底调查,采集15个养殖场(户)合计90份鼻腔棉拭子和74份血清样品,分别采用荧光RT-PCR方法和酶联免疫吸附试验检测小反刍兽疫病原和抗体,评估该地区在小反刍兽疫强制免疫前传入羊群的风险.检测结果显示,同安区在未全面开展强制免疫前,小反刍兽疫抗体个体阳性率为25.7%,场(户)阳性率为33.3%,病原阳性率为0.初步判定,该地区在没有进行小反刍兽疫强制免疫的情况下,疫情发生的风险较大.提出应立即开展小反刍兽疫免疫、强化检疫监管、提高养殖户和屠宰场生物安全管理水平.