携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗对羊只的免疫效果评价

为了掌握不同免疫方法对羊只免疫抗体的影响,降低免疫成本,提高免疫质量,开展了小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗(Clone9株+AV41株)对羊只免疫效果的试验.结果 显示:小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗在羊只上免疫效果不理想.建议在防控小反刍兽疫和羊痘病毒时两者不能混在一起接种,重组使用会降低两者抗体效价.     

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。     

小反刍兽疫-山羊痘二联活疫苗免疫效果试验及结果分析

为了验证某公司生产的小反刍兽疫—山羊痘二联活疫苗(Clone9株+AV41株)对张掖市甘州区绵羊的免疫效果,为养羊户选择疫苗提供参考,选择一群全舍饲养殖的绵羊并进行了分组,分别应用该小反刍兽疫-山羊痘二联活疫苗和已经使用过的小反刍兽疫活疫苗、山羊痘活疫苗进行注射免疫,观察免疫后羊只采食、精神状态、发病和死亡等情况。免疫前和免疫后第8 d、15 d、22 d分别采血进行实验室抗体检测。结果表明:该二联活疫苗安全性较好,免疫性方面,二联苗与单苗比较,第8 d羊痘抗体转阳个体增加数无显著差异,而小反刍兽疫差异极显著,第15 d羊痘抗体转阳个体增加数差异显著,小反刍兽疫差异极显著。在目前小反刍兽疫疫苗来源单一,价格坚挺、山羊痘疫苗紧缺的情况下,该二联苗具有一定的可替代性。     

采用非洲地区广泛应用的绵羊痘弱毒株构建表达小反刍兽疫病毒H蛋白的重组疫苗

为构建表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因的重组绵羊痘病毒(SPV),本研究利用e GFP报告基因和gpt筛选基因筛选纯化了PPRV H基因的重组SPV(rSPV-PPRV-H)。通过PCR、序列测定和间接免疫荧光的方法对rSPV-PPRV-H进行鉴定。结果显示PPRV的H基因重组至rSPV-PRRV-H中并表达PPRV H蛋白;同时病毒的生长曲线也显示外源H基因的插入并未影响亲本病毒的复制。将该重组病毒经皮内注射途径免疫绵羊,免疫剂量为105.5 TCID50,间隔4周,免疫两次,中和试验结果显示rSPV-PPRV-H免疫绵羊后能够诱导其产生高滴度的抗PPRV的特异性中和抗体,抗体转阳率为100%(6/6)。本研究为rSPV-PPRV-H作为PPRV疫苗提供了实验依据。     

小反刍兽疫-羊痘二联活疫苗田间免疫试验评价

为弄清小反刍兽疫-山羊痘二联活疫苗(Clone9株+AV41株)田间临床免疫效果,2020年11月至2022年1月期间,随机采集免疫小反刍兽疫-羊痘二联疫苗后不同时间段的血清样品进行免疫抗体检测,同时对小反刍兽疫-羊痘二联疫苗的安全性和田间免疫效果进行评价。结果：除个别羊只体温略有升高、采食量略有下降外,其他羊只均未出现免疫应激反应及反应死亡病例报告。在免疫后7 d小反刍兽疫免疫抗体阳性率逐渐上升,14 d到达最高值100%,直到360 d仍维持在80%以上,免疫效果较为理想;而在免疫后7 d羊痘免疫抗体阳性率仍为0,14 d达到最高值37.14%,随后持续下降,直到免疫后360 d抗体阳性率仍然维持在较低水平,免疫效果不理想。     

山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测.     

羔羊小反刍兽疫母源抗体消长规律

为合理制定羔羊小反刍兽疫(PPR)的免疫程序,采用中和试验研究了羔羊母源抗体消长规律。结果表明:羔羊出生后7~45 d血清抗体水平较高(抗体效价≥1∶40血清比例均大于80%),抗体保护率达90%以上,其中7~14 d血清抗体水平最高(抗体效价≥1∶40血清比例均大于90%),抗体保护率达100%。14 d以后血清抗体水平开始降低,90 d时血清抗体保护率降到了60%。对于经免场PPR的最佳免疫时间应选择在断奶后30日龄左右,即60日龄断奶,90日龄免疫;90日龄断奶,120日龄免疫。     

小反刍兽疫病毒F蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组质粒F-p Fast Bac HTA,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒F-Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,获得含有PPRV F基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出59 ku左右的表达蛋白,Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测该蛋白具有很好的反应原性。通过免疫BALB/c小鼠,ELISA结果证明F蛋白可以诱导产生高水平的血清抗体;MTT试验结果显示F蛋白能刺激T淋巴细胞增殖;说明表达的F蛋白具有良好的免疫原性。以上研究结果为小反刍兽疫病毒的检测方法及亚单位疫苗的研究奠定基础。     

小反刍兽疫免疫荧光诊断技术研究

为了建立小反刍兽疫(PPR)荧光抗体诊断方法,研究选用小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1减毒疫苗株制备抗原,免疫试验山羊,制备小反刍兽疫高免血清,用硫酸铵盐析法粗提免疫球蛋白(IgG),再应用提取的IgG制备异硫氰酸荧光素标记抗体。结果表明:所制备的荧光抗体对试验用Vero细胞组织抗原和犬瘟热病毒(CDV)抗原无反应性,对小反刍兽疫病毒感染细胞的检出敏感性为1×106稀释度。