表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组病毒免疫及强毒攻击后外周血T淋巴细胞亚群的动态

采用流式细胞检测技术对表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV-gB-F）、新城瘦弱毒疫苗以及传染性喉气管炎弱毒疫苗免疫和传染性喉气管炎以及新城疫强毒攻击后外周血T细胞表型亚类（CD4^＋、CD8^＋、XCRγδ^＋）的变化动态进行监测。重组疫苗和禽痘疫苗免疫之后，CD8^＋和TCRγδ^＋的细胞数先升高后回落；在NDV强毒攻击之后，ND疫苗免疫组的TCRγδ^＋数量升高，rFPV-gB-F免疫组的三种细胞数量在第l周都下降，随后升高；ILT疫苗在免疫后的第1周，CD4^＋细胞数量下降。结果提示rFPV-gB-F可以诱发相应的细胞免疫应答，但是有关传染性喉气管炎病毒导致的细胞免疫需要进一步的研究，     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。     

传染性喉气管炎新城疫鸡痘重组病毒免疫效力的研究

在表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组鸡痘病毒(rF-PV-gB-F)安全性检验合格后,以5.0×101~5.0×104PFU不同含量按0.1mL/鸡的剂量免疫100只30日龄SPF鸡,30d后分组分别用ILTVWG株和NDVF48E9株强毒进行攻击。免疫鸡抗鸡痘病毒抗体都转为阳性,痘反应和接种剂量有关,重组疫苗的最小反应剂量为50PFU。重组疫苗可以诱发对新城疫和传染性喉气管炎的保护,0.1mL/鸡的接种量在500~5000PFU浓度范围内的免疫效果最好,对于ILTV攻击的发病保护率在70%以上,对NDV强毒攻击的抗死亡保护率可以达到80%,这为进一步考察疫苗的免疫效力试验以及进行田间试验奠定了基础。     

1日龄雏鸡免疫鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗安全性及效力的研究

将鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗以皮下注射和皮下刺种2种不同免疫途径免疫1日龄雏鸡,评价其安全性和效力。以10羽份/只剂量接种后,两组鸡均未观察到全身反应。以1羽份/只剂量接种后28d攻毒,两种免疫方式均可以使免疫鸡产生较强免疫力,能够抵抗传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株强毒和鸡痘病毒(FPV)102株的攻击。以上结果显示,鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗以皮下注射和皮下刺种2种不同途径免疫1日龄雏鸡,具有良好的安全性和有效性。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒（rFPV-ILTVgB)的稳定性，我们对重组病毒进行6代和16代克隆纯化，对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传20代，结果发现第6代纯化病毒（rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现，说明病毒纯度不够；经过16代纯化的病毒（rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强，病毒的效价进一步升高，20代传代后蓝斑率仍然为100％，PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第5，10，15，20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡，20天后分为两组，分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株攻击，结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击，鸡体内病毒传代试验表明，重组病毒在接种部位仅存在6天，之后就检测不到病毒，重组病毒通过SPF鸡连续传代，不存在病毒返祖的可能，由此可以得出一个结论：rFPV-ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的，无论是在体外传代，还是在体内均可以稳定遗传，不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能，完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。     

传染性喉气管炎病毒基因疫苗免疫效应

以传染性喉气管炎病毒（ILTV）WG株gB和gD基因为目的基因构建真核表达质粒pCAGG-gB和pCAGG-gD。将75只SPF鸡随机分为7组，经肌肉注射接种pCAGG-gB、pCAGG-gD、pCAGG-gB＋pCAGG-gD、pCAGG-gB＋rFPV-ILTVgB以及rFPV-ILTVgB，并设有生理盐水和空载体（pCAGG）对照组。免疫2周后以500EID50 ILTV WG株强毒进行攻击，以评价ILTV基因疫苗以及基因疫苗和重组病毒联合应用对SPF鸡的免疫保护作用。血清抗体的检测表明：在免疫后的2周，各免疫组的鸡只均产生了特异性的ILTV抗体，外周血CD4^＋T、CD8^＋T、TCRTγδ^＋T细胞明显高于对照组，并且pCAGG-gB和pCAGG-gD分别诱导了高水平的IL-18和IFN-γ的表达。ILTV强毒攻击后，非免疫鸡全部发病，并在第2天出现死亡。而各质粒免疫组均获得了一定的保护（保护率44％），两种质粒联合免疫（pCAGG-gB和pCAGG-gD）和重组病毒（rFPV-ILTVgB）与质粒（pCAGG-gB）联合免疫的免疫组的保护率（56％）高于单独免疫组，产生高水平细胞因子表达的免疫组的保护率高于对照组。重组鸡痘病毒免疫组的保护率（69％）最高。这些结果表明ILTV的DNA疫苗能够诱导鸡体产生特异性免疫应答，并能对传染性喉气管炎强毒的攻击提供一定的免疫保护。     

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养,加入适当的保护剂制成冻干疫苗.取3批冻干疫苗,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种14日龄和50日龄SPF鸡,接种剂量为5 × 106PFU,接种后3天出现局部反应,5天局部肿胀达到最大,接种鸡无其它全身反应,精神、食欲以及发育等均不受影响,说明重组病毒对试验鸡是安全的.取其中的200003批疫苗,用生理盐水作210-2～210-5稀释后,翅内侧无血管处皮下接种40日龄SPF鸡,免疫后4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株,结果表明,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力,在接种剂量为210-2～210-40.1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应,当接种剂量为210-50.2ml/鸡时可以使部分试验鸡(5/15)产生局部反应,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为210-40.1ml(相当于1000PFU).攻毒试验结果进一步证明,当接种剂量为210-40.1ml(相当于1000 PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒102株的攻击,降低鸡群的发病率和病死率.这些结果说明,疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性,疫苗对接种鸡的局部作用反应了疫苗的免疫效力,我们研制的重组疫苗的最小免疫剂量为1000 PFU,这就为我们进一步考察疫苗的免疫效力试验奠定了基础.     

新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

以新城疫病毒F基因的cDNA与真核表达载体pcDNA3重组 ,构建了新城疫病毒F基因疫苗。采用不同剂量接种SPF鸡后 ,通过抗体监测和强毒攻击试验 ,分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明 ,接种剂量为1 0 0 ,2 0 0ug时 ,试验鸡在免疫后第 2周出现较明显的抗体反应 ,接种剂量为 1 0ug时抗体变化不明显。以标准强毒F4 8E9攻击后 ,空白对照组及接种剂量为 1 0 ,1 0 0ug组的鸡只全部发病死亡 ,未获得免疫保护 ;而 2 0 0ug组鸡只 30 %存活 ,获得部分免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系     

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病.在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件.在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护.在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体.这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播.     

成疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

以新城疫病毒Ｆ基因的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３重组，构建了新城疫病毒Ｆ基因疫茵。采用不同剂量接种ＳＰＦ鸡后，通过抗体监测和强毒攻击试验，分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明，接种剂量为１００，２００ｕｇ时，试验鸡在免疫后第２周出现较明显的抗体反应，接种剂量为１０ｕｇ时抗体变经不明显。以标准强毒Ｆ４８Ｅ９攻击后，空白对照组及接种剂量为１０，１００ｕｇ组的鸡只全部发病死亡，未获得     

鸡新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

本研究以新城疫病毒 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 与真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 重组，构建了新城疫病毒 Ｆ基因疫苗。采用不同剂量接种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡后，通过抗体监测和强毒攻击试验，分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明，接种剂量为１００μｇ、２００ μｇ 时，试验鸡在免疫后第 ２ 周出现较明显的抗体反应，接种剂量为 １０ μｇ 时抗体变化不明显。以标准强毒 Ｆ４８ Ｅ９ 攻击后，空白对照组及接种剂量为１０ μｇ 和１００ μｇ 组的鸡只全部发病死亡，未获得免疫保护；而２００ μｇ 组鸡只全部存活，获得完全免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系。     

新城疫LaSota活疫苗对基因Ⅶ型分离株的免疫保护性试验

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒(NDV),命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因Ⅶ型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSot a后14 d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10 d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9 d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLYO1攻毒组第5 d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSot a活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100%免疫保护,但不能完全抑制基因Ⅶ NDV分离株在体内的复制和排毒。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强株VP2基因重组新城疫病毒胚胎免疫安全性及效力试验

为研制能够同时预防传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)的疫苗,本研究选用表达IBD病毒(IBDV)超强毒株(vvIBDV)VP2基因的重组ND病毒(NDV)LaSota疫苗株(rL-VP2),测定其半数鸡胚感染量、平均鸡胚致死时间、脑内接种指数和静脉内致病指数等指标,按不同剂量接种18胚龄SPF鸡胚,分别于出雏后第9d、第14d和第21d采血,用微量凝集法和ELISA方法测定血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平,并于出雏后28d用NDV强毒(F48E9株)和vvIBDVGx株攻毒,评估重组疫苗的胚胎免疫效果。结果显示:按104EID50/枚剂量进行免疫不会影响SPF鸡胚出雏率和出雏后21d存活率,并且该免疫组雏鸡能够对NDV强毒和vvIBDV攻毒提供安全的免疫保护。     

中药制剂对禽流感病毒H9N2、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸡毒支原体的攻毒保护试验

采用以野菊花、穿心莲、柴胡等10味中药提取的中药制剂,连续给22日龄SPF鸡口服5 d后,以禽流感病毒H9N2、新城疫病毒F4、传染性支气管炎病毒强毒株M41和支原体S6强毒分别攻击,观察SPF鸡临床症状、发病率、病理学变化和分离病毒。结果表明,此中药制剂75 mg/只口服组,新城疫病毒、禽流感病毒和传染性支气管炎病毒攻击后发病率分别为12.5%,0%,10%;37.5 mg/只剂量口服组发病率分别为50%,10%,10%,且低剂量组病毒分离阳性。攻击支原体后,以上两个剂量组SPF鸡病变指数分别3.5和5.5,研究证实本中药制剂可以控制以上4种病原所致的家禽呼吸道病的发生。     

牛传染性鼻气管炎弱毒与牛病毒性腹泻弱毒抗原免疫干扰的研究

本试验使用3~6月龄健康易感牛9头(牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体均阴性),共分3组,每组3头犊牛。第1组首免肌肉注射IBRV-LNM弱毒疫苗株种毒,接种1周后,每头牛接种BVDV-SM弱毒疫苗株;第2组只接种BVDV-SM弱毒疫苗株种毒,接种时间同第1组;第3组为对照组,接种MDBK细胞培养液。接种BVDV-SM疫苗毒后每周采血至疫苗毒接种后28 d,测定接种后BVDV抗体效价,并采用BVDV-JL检验用强毒进行攻毒试验。结果表明,第1组与第2组试验动物血清中牛病毒性腹泻病毒抗体水平无明显差异,能够抵抗BVDV-JL强毒攻击达到免疫保护的效果,说明牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LNM弱毒疫苗株接种后在牛体内对牛病毒性腹泻病毒BVDV-SM疫苗毒不产生免疫干扰作用。     

鸡传染性喉气管炎病毒(江苏株)的分离与初步鉴定

本研究从江苏省某养鸡场采集临床疑似鸡传染性喉气管炎(infectious laryngotracheitis,ILT)的病鸡喉头气管,接种鸡胚绒毛尿囊膜分离病毒,命名为LJS091151。以分离毒人工感染SPF鸡,于攻毒后d3出现了ILT的典型临床症状,剖检亦可见喉头气管黏膜充血肿胀、消化道空虚、黏膜充血等病理变化。根据GenBank发表的鸡传染性喉气管炎病毒(Infectiouslaryngotracheitis virus,ILT)gB、TK基因保守序列设计2对引物对分离株基因组DNA进行扩增和序列测定。序列分析表明,获得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank发表的序列相似性均在99%以上,证明了分离株LJS091151为鸡传染性喉气管炎病毒。     

Immune protection assay of Newcastle disease live vaccine （LaSota Strain） against a genotype VII NDV isolate

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒（NDV）,命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因VII型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSota后14d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLY01攻毒组第5d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSota活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100％免疫保护,但不能完全抑制基因VIINDV分离株在体内的复制和排毒。     

鸡传染性喉气管炎病毒SA2疫苗株免疫效力的研究

鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）疫苗株尿囊膜乳剂原液经点眼接种２、７和１５日龄雏，２日龄雏鸡组在接种后第７天有２０％（１／５）鸡出现眼睑肿胀和流泪等眼部反应，７日龄和１５日龄雏鸡组无明显临床变化。用该疫苗株乳剂原液点眼接种１月龄以上鸡眼部无明显反应，但通过气管接种后，２６．７％（４／１５）鸡表现出ＩＬＴ临床症状。试验用ＳＡ２株点眼接种免疫１月龄以上鸡，免疫组保护率为１００％（２０／２０），对照组发病率为１００％（１０／１０）、死亡率为４０％（４／１０）。２、７和１５日龄雏鸡点眼毒力试验的３组鸡，于接种后２１～３４天用王岗株ＩＬＴ强毒攻击，１００％得到保护，而对照组鸡１００％发病。试验结果表明，ＳＡ２疫苗株是一株毒力温和、副作用小而且免疫效力好的疫苗用毒株     

鸡新城疫病毒的分离与鉴定

应用鸡胚接种技术从南宁市郊区一个疑似发生新城疫鸡群采集的样品中分离到一株病毒,经对分离毒株进行血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,结果表明分离的毒株为新城疫病毒;对分离株进行毒力测定、致病性试验及对包含裂解位点的F基因部分片段的序列进行测定与遗传进化分析。结果表明,毒株对鸡胚平均致死时间为62.6 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.56,30日龄易感鸡攻毒后2 d开始出现明显的临床症状,攻毒后5 d内全部死亡,表明该分离株属新城疫强毒株,F基因裂解位点氨基酸基为112RRRKRF117,F基因遗传进化分析发现该毒株属于基因Ⅶ型,与同年从广西发病的白鹭分离的新城疫毒株亲缘关系较近。