鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的鉴定

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)B细胞抗原表位,本研究将IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ病毒与重组N蛋白作为免疫原,交叉免疫BALB/c小鼠,制备了1株抗IBV N蛋白的单克隆抗体(MAb)6D10。Westernblot结果表明该MAb可特异性的识别IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株和重组N蛋白。同时利用噬菌体展示技术对IBV N蛋白抗原表位进行筛选,获得11个阳性噬菌体克隆。序列分析表明,这11个克隆均展示有"FGPRTK"6个氨基酸的序列,对应于IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株N蛋白242位～247位氨基酸残基。同时,通过人工合成其编码序列并进行原核表达,利用MAb6D10对表达产物进行western blot分析,反应性良好。由此表明"FGPRTK"6肽为IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株的一个线性B细胞抗原表位。表位的保守性分析结果表明,本研究鉴定的表位在各种血清型IBV毒株中均高度保守。本研究结果为进一步研究IBV N蛋白抗原的结构和功能及诊断试剂的研发奠定了基础。     

一株25型蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体识别表位的鉴定

为研究本实验室制备的一株抗25型蓝舌病病毒(BTV-25)VP7蛋白单克隆抗体(MAb)3H7识别的B细胞抗原表位,本研究利用噬菌体展示技术对3H7识别的抗原表位进行鉴定。经过3轮淘选后进行测序,测序结果经分析比对后获得共同的短肽序列为QYHAM;将该短肽序列合成后与3H7细胞上清和腹水均能够发生特异性反应;与BTV1~24型标准阳性血清的间接ELISA结果均呈现阳性反应;进一步的序列分析表明该表位的氨基酸序列QYHAM在不同血清型的BTV株间保守,确定该MAb识别的VP7抗原表位为238QYHAM242,本研究对于BT疫苗的设计及高通量检测试剂盒的研制均具有重要意义。     

蓝舌病病毒3型VP5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备血清3型蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用pMAL-C4x原核表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗BTV3 VP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(3F2)。间接免疫荧光结果表明:MAb 3F2与BTV3、BTV5、BTV9、BTV16呈阳性反应;与BTV6、BTV7、BTV13、BTV21呈弱阳性反应;与其它BTV血清型均呈阴性反应。利用原核表达的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合短肽对MAb 3F2识别的抗原表位进行鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为89PGERGIQMKIKEIEEE104。氨基酸序列比对结果显示该表位在不同地域来源的BTV3株间比较保守。该MAb的制备和鉴定为进一步研究VP5蛋白的结构和功能奠定了基础。     

A组猪轮状病毒NSP3蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP3的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究将原核表达、纯化的重组NSP3蛋白(r NSP3)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA法筛选,得到一株能够稳定分泌抗Po RV(G9)的杂交瘤细胞株(5B8)。MAb鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1型;MAb细胞培养上清液效价为1∶103,western blot及间接免疫荧光结果表明该株MAb能够与Po RV反应。对NSP3蛋白进行截短表达,采用western blot试验确定所获得的MAb识别的抗原表位区域序列为290QDYD RTFL297。该MAb的制备为进一步研究NSP3蛋白的结构和功能奠定了良好的基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株GP3单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV) GP3株的单克隆抗体(MAb),本研究将HP-PRRSV HuN4株免疫BALB/c小鼠,以该病毒感染的细胞及真核表达的GP3蛋白为检测抗原,经间接免疫荧光(IFA)筛选获得了一株稳定分泌MAb的细胞株,命名为4G5.抗体亚类鉴定重链类型为IgG1,轻链类型为K.该MAb细胞培养上清及腹水IFA效价分别为1∶256和1∶1 280.IFA结果显示,MAb 4G5能够识别CH-1R、JXA1-R、HP-PRRSV HuN4株及其疫苗株HuN4-F112,而不识别RespPRRS MLV病毒株.Western blot结果显示,4G5与HP-PRRSV HuN4株及原核表达的GP3蛋白均可以反应,表明其针对的抗原表位为线性表位,中和试验结果显示该MAb无中和活性.通过截短表达GP3蛋白鉴定该MAb抗原表位识别序列为74WCRIGHDRCS83.本研究获得的MAb为进一步研究HP-PRRSV GP3蛋白的结构及功能奠定了基础.     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g D蛋白抗原表位,本研究利用p ET-30a原核表达系统表达、纯化了重组g D蛋白,采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,取脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以重组g D蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗g D蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1G3)。间接免疫荧光结果表明:MAb与IBRV呈阳性反应,中和试验测定其腹水中和效价为1∶32。利用肽扫描技术原核表达GST融合短肽对MAb 1G3识别的抗原表位进行筛选鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为259EESKGYE265。蛋白序列分析表明该抗原表位在IBRV各分离株及牛疱疹病毒5型(Bo HV-5)中均保守。本研究为IBRV的糖蛋白g D的结构和免疫学特性及IBRV致病性的深入研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒NSP5蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NSP5蛋白的单抗隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达并纯化的重组NSP5蛋白(r NSP5-GST)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛出一株稳定分泌抗TGEV NSP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(5C3)。MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶6 400和1∶105。Western blot鉴定表明该MAb能够识别原核及真核表达的NSP5重组蛋白。利用肽扫描法鉴定显示,该MAb识别的抗原表位为286EFTPTEVIR QMYGVN300。本研究制备的MAb及其抗原表位的鉴定,为TGEV NSP5蛋白结构和功能的研究奠定了基础。     

禽流感病毒M1蛋白表(拟)位定位及免疫检测分析

为对禽流感病毒(AIV)M1蛋白表(拟)位进行分析,本研究采用针对AIV M1蛋白的型特异性单克隆抗体(MAb),淘选M13噬菌体展示的7肽随机肽库,进行M1蛋白表(拟)位分析。筛选获得共有序列MDRxL或HPR,定位于M1蛋白93～99位(93MDRAVKL99)和222～230位(222HPNSSAGLR230)氨基酸区域。采用ELISA、竞争性ELISA分析不同噬菌体拟位与抗M1的MAb免疫反应性,表明含有MDRxL或HPR基序的噬菌体拟位能够与MAb发生特异性结合,并且其结合能够被天然病毒抗原抑制或阻断,表明拟位多肽真实模拟病毒蛋白上与MAb结合的抗原决定簇或表位,提示M1蛋白93～99位(93MDRAVKL99)和222～230位(222HPNSSAGLR230)氨基酸区域构成AIV型特异性表位。     

副猪嗜血杆菌寡肽结合蛋白（OPPA）的序列分析及分子结构模拟

通过研究副猪嗜血杆菌（Haemophiius parasuis,Hps）寡肽结合蛋白（Oligopeptide Binding Protein A,OppA）的生物学特性,为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的研制奠定基础。本试验设计了1对特异性引物,应用PCR方法来扩增副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白的全基因序列,并进行克隆和测序。并且采用生物信息学方法,对Hps的oppA基因核苷酸及其对应氨基酸序列进行比对,选取其中的血清学5型分离株,对其OppA蛋白的分子结构、理化性质及结构功能域、蛋白质二级结构等重要参数进行了预测和分析,并对0ppA蛋白的三级结构进行了同源建模。PCR扩增出1638bp的目的片段;测序结果显示出不同血清型Hps之间oppA基因核苷酸序列相似性有一定的差异,而所对应的氨基酸序列却差异更小;OPPA蛋白的理论等电点为6．45,偏弱酸性;OppA蛋白的二级结构以α螺旋、不规则卷曲和8片层为主要构件;Hps的0ppA蛋白的氨基酸序列与鼠疫耶尔森氏菌2223蛋白的同源性为57．20％,以2223蛋白结构为模板成功构建了Hps的OppA蛋白三维结构分子模型,该OppA蛋白三维结构中与2223蛋白相似,也有3个结构域,在疏水口袋中有1条5肽结构。Hps的OppA蛋白的成功模建为OppA蛋白功能的深入研究提供了参考依据。     

抗禽白血病病毒p27蛋白线性抗原表位的鉴定

为鉴定禽白血病病毒(ALV)p27蛋白中的线性抗原表位,本研究以原核表达的重组p27蛋白免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA方法筛选纯化获得一株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。Western blot试验结果显示,该MAb可以识别ALV的群特异性抗原p27蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,MAb与A、B和J亚群ALV均呈阳性反应。对p27蛋白进行截短表达,利用western blot和间接ELISA进行表位鉴定,确定了MAb所识别的抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比对结果显示,本研究所鉴定出的p27表位在A、B和J亚群ALV之间高度保守。本研究为ALV检测方法的建立及其免疫学功能的研究提供了有利的工具。     

抗猪PD-L1分子的单克隆抗体制备及免疫学特性分析

为制备抗猪程序性死亡因子配体1 (PD-L1)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其免疫学特性,本研究将猪PD-L1基因的外膜区利用原核表达载体pET32a进行表达,以纯化的表达蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以表达PD-L1-Fc蛋白的293T细胞作为抗原,采用间接免疫荧光试验筛选杂交瘤培养上清,获得两株稳定分泌抗猪PD-L1 MAb的杂交瘤细胞系.MAb亚型鉴定均为IgG1型,轻链为(K)链.Western blot试验表明这两株MAb均可以特异性识别PD-L1蛋白.流式细胞检测结果显示这两株MAb可以识别表达于293T细胞膜表面的PD-L1分子,但不能阻断PD-L1分子与其受体PD-1的结合.这两株MAb的获得为研究PD-1/PD-L1通路与猪的某些感染性疾病发展进程的关系提供了必要的检测工具.     

猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体的制备及B细胞线性表位鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV HeN1株全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接免疫荧光方法筛选,获得了一株稳定分泌抗PRV g B蛋白的杂交瘤细胞株1E7。Western blot结果显示,MAb 1E7与PRV全病毒和真核表达的g B蛋白均能够反应。阻断ELISA试验显示MAb 1E7与PRV的结合可以被猪阳性血清阻断。抗体亚类鉴定显示MAb 1E7的重链为Ig G2b亚类,轻链为kappa链。利用大肠杆菌原核表达系统,表达一系列截短的g B蛋白,最终确定1E7识别的抗原表位是~(81)SAEESLE~(87)。序列分析和western blot结果表明该表位在各PRV病毒株间相对保守。该MAb的制备为建立具有广泛适用性检测PRV野毒感染和疫苗免疫效果评价的阻断ELISA方法奠定了基础。     

蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10.Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/k链.Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白.间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应.利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546.本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础.     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

猴免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定

为鉴定抗猴免疫缺陷病毒(SIV)衣壳蛋白p27单克隆抗体(MAb) p27-A5、p27-C7和p27-D2所识别的抗原表位,本研究通过间接ELISA法相加试验对这3株MAbs结合抗原表位进行初步分析,并利用部分重叠的短肽对MAbs的结合抗原表位进行鉴定.结果表明p27-C7和p27-A5的结合抗原表位位于p27蛋白的aa61～aa76(氨基酸序列为61SEGCTPYDINQMLNCV76);p27-D2的结合抗原表位则位于aa191～aa206(氨基酸序列为191EQTDAAVKNWMTQTLL206).该结果为进一步深入了解p27的抗原特性和建立该蛋白的检测方法奠定了基础.     

一株抗马传染性贫血病毒p26蛋白单克隆抗体识别差异表位鉴定

为研究本实验室制备的抗马传染性贫血病毒(EIAV)p26蛋白单克隆抗体(MAb)1G11的B细胞表位识别特性,本研究通过对不同EIAV株p26蛋白进行系统进化分析,将其划分为3大分支群。根据已经鉴定的线性表位(命名为1G11),通过对3个分支群中的8株代表性病毒株p26蛋白1G11表位区域分析,并原核表达8株病毒1G11表位区域多肽P26-(1~8),经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果表明除表位多肽P26-7以外,其他多肽均能够被MAb 1G11所识别。分析显示P26-7多肽序列同时发生N200S和M215L变异。由于N200S和M215L单独改变并不影响MAb 1G11识别,因此我们推测N200与M215同时改变可能影响两侧末端半胱氨酸(C)及附近氨基酸所形成的表位构象,进而影响MAb 1G11识别;同时,其他氨基酸差异并不影响MAb 1G11识别,表明该抗体对1G11表位区域识别具有广谱性。这为进一步应用该MAb作为检测抗体和开发广谱性诊断检测方法提供了依据。     

H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原表位的筛选及其抗原性分析

本研究旨在对H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原分子的模拟表位进行分离鉴定并分析其抗原性。用抗H1N1猪流感病毒血凝素蛋白小鼠血清IgG对噬菌体随机12肽库进行筛选,3轮亲和筛选后,特异性噬菌体得到了有效富集;对随机挑选的47个噬菌体克隆用ELISA进行鉴定,其中40个为阳性;对40个阳性克隆测序得到3种不同氨基酸序列;用Western blotting对获得的3个不同序列的噬菌体克隆进行抗原性分析,显示这3种噬菌体插入短肽能和H1N1猪流感病毒感染小鼠血清特异性结合。结果表明,本试验获得了3种H1N1猪流感病毒血凝素蛋白模拟抗原表位,它们都具有明显的抗原性,为H1N1猪流感病毒的疫苗研究和诊断奠定了基础。     

一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备抗猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白(r VP2),纯化后将其免疫BALB/c小鼠,取免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出一株稳定分泌抗VP2 MAb(1D3)。通过间接免疫荧光试验和western blot对该MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明1D3 MAb仅能够特异性与EMCV全病毒反应。此外,通过构建截短的VP2蛋白重组质粒,采用western blot的方法对VP2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 1D3识别的线性表位区域为89DGGVFGAALRRH100。本实验结果为进一步研究VP2蛋白的功能及建立EMCV检测方法奠定了基础。     

抗禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

为制备抗禽流感病毒(AIV)NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位鉴定,本研究以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,制备的D7和D9 2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAb的杂交瘤细胞,亚型鉴定均为IgG1型,轻链均为k链.Western blot鉴定表明,这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白.间接免疫荧光鉴定表明,这2株MAbs均能够识别真核表达的NS1蛋白.利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTV,与NS1蛋白aa 182～aa 187基本匹配,提示182WNDNTV187为NS1蛋白的一个线性表位.该结果为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段(P97CR1)作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。