中国3种旧大陆猴TRIMCyp嵌合基因的存在状况及基因特性研究

本研究应用PCR方法检测了中国3种旧大陆猴(恒河猴、食蟹猴及藏酋猴)的TRIMCyp嵌合基因型个体的存在状况,并首次发现携带TRIMCyp嵌合基因中国品系恒河猴。同时本实验应用建立RT-PCR方法在mRNA水平上进一步检测了恒河猴和食蟹猴的TRIMCyp嵌合基因序列和特性。其编码的融合蛋白TRIMCyp丧失了对HIV-1复制的限制功能,推测具有该基因型旧大陆猴对HIV-1更易感,可用于建立新型的艾滋病非人灵长类动物模型。本研究结果将促进逆转录病毒跨种间传播的研究和建立HIV-1易感非人灵长类动物模型。     

通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失对EIAV疫苗株EIAV_(FDDV12)体内复制的影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了。我们的前期研究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子,使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用,本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上,构建了gp45截短型感染性克隆,脂质体转染细胞,增殖传代,获得病毒株EIAVFDDVTM-36,接种到马体内。在接种后167 d内未观察到临床症状,连续注射10 d地塞米松以暂时抑制免疫系统,并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示,截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著,而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升,同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明,马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响,而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制,显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高,可以促使机体产生更高的中和抗体效价,提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此,安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。     

马属动物SLFN11具有促进马传染性贫血病毒复制的能力

SLFN是一类干扰素诱导蛋白,还可以通过干扰素调节因子(IRF3)途径被病原体直接诱导表达。最新研究表明,SLFN11可通过抑制病毒蛋白合成,对慢病毒属的HIV-1具有明显抗病毒作用。为阐明SLFN11对马传染性贫血病毒(EIAV)的作用,本研究采用RT-PCR技术从健康马淋巴细胞中首次扩增获得SLFN11基因,构建了真核表达重组质粒pHA-eSLFN11。将其与EIAV的感染性克隆共转染HEK293T细胞,western blot检测结构蛋白的表达情况,并采用激光共聚焦试验分析SLFN11在亚细胞中的定位。研究结果显示,SLFN11能够促进EIAV结构基因(Gag)的表达,此外马源SLFN11(eSLFN11)与人源SLFN11(hSLFN11)明显定位不同。以上结果提示,eSLFN11与EIAV的作用明显区别于hSLFN11对HIV-1的限制作用,其机制有待进一步研究。     

马传染性贫血弱毒疫苗株致弱过程中表面蛋白gp90的进化分析

为进一步研究马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机制,本实验对EIAV弱毒疫苗的原始种毒EIAVLN40、亲本病毒株EIAVDV、驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121和EIAVDV减毒过程中的3个中间代次病毒(EIAVDLV32、EIAVDLV62和EIAVDLV92)的gp90基因进行测序分析。结果显示,适应白细胞培养的病毒株的进化距离更接近,与亲本病毒株处于进化树的不同分支。与强毒株相比,适应白细胞培养的病毒株在9个位点发生优势氨基酸的转换和V3区糖基化位点191NSSN194的缺失。此外,伴随EIAV毒力减弱的过程,有8个位点出现优势氨基酸残基的转换,在各代次病毒株中V4区具有糖基化位点237NNTW240和246NETW249的克隆所占的比例逐渐降低,其中EIAVDLV121的糖基化位点237NNTW240完全缺失。     

猴免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定

为鉴定抗猴免疫缺陷病毒(SIV)衣壳蛋白p27单克隆抗体(MAb) p27-A5、p27-C7和p27-D2所识别的抗原表位,本研究通过间接ELISA法相加试验对这3株MAbs结合抗原表位进行初步分析,并利用部分重叠的短肽对MAbs的结合抗原表位进行鉴定.结果表明p27-C7和p27-A5的结合抗原表位位于p27蛋白的aa61～aa76(氨基酸序列为61SEGCTPYDINQMLNCV76);p27-D2的结合抗原表位则位于aa191～aa206(氨基酸序列为191EQTDAAVKNWMTQTLL206).该结果为进一步深入了解p27的抗原特性和建立该蛋白的检测方法奠定了基础.     

重组截短型ELR1蛋白在昆虫表达系统中的分泌表达与结晶

为获得马传染性贫血病毒单一受体(ELR1)的结晶体,本研究通过PCR方法获得ELR1胞外区基因片段,利用基因重组技术构建包含ELR1胞外区基因的重组杆状病毒表达质粒(Bacmid-ELR1).将其转染至昆虫细胞sf9中进行蛋白表达,western blot检测结果显示ELR1胞外区截短型重组蛋白在昆虫表达系统中获得表达.目的蛋白经亲和层析和凝胶过滤方法纯后化,通过多组结晶条件筛选获得了ELR1胞外区重组蛋白结晶体.本研究为ELR1立体结构和功能的解析提供了重要基础.     

马传染性贫血病毒受体选择性剪接异构体的鉴定与分析

马慢病毒受体1(ELR1)是马传染性贫血病毒(EIAV)唯一受体,属于肿瘤坏死因子受体超家族。为研究ELR1 mRNA选择性剪接的状况,本研究从EIAV靶细胞的巨噬细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增并克隆测序。结果显示,ELR1 mRNA具有不同形式的选择性剪接异构体,主要表现为插入和缺失形式。插入片段为153 bp,位于序列的786 nt～787 nt之间,而缺失型异构体丢失了ELR1序列的415 nt～478 nt。不论序列的插入或缺失,均导致该基因编码框移位。特别是插入型异构体,编码框在跨膜区之前遇到终止密码子,造成翻译的提前终止,推测产生截短的可溶性ELR1。这些剪接异构体的鉴定为研究EIAV与机体的相互作用提供了新的研究方向。     

感染马传染性贫血病毒的巨噬细胞差异表达蛋白质组分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染其主要靶细胞马巨噬细胞(eMDM)后与细胞蛋白的相互作用,本研究采用EIAV强毒株EIAVDLV34感染48 h后的马外周血单核细胞分化的eMDM,并以未感染eMDM为对照,提取细胞的蛋白质样品,进行双向凝胶电泳(2-DE)分离,并分析凝胶中差异蛋白点。结果共检测出19个表达差异的蛋白点(ratio1.4,p0.05),其中感染组相对于对照组有7个蛋白质上调表达,12个蛋白质呈现下调表达。将差异蛋白进行串联质谱分析进行鉴定,并通过生物信息学方法对这19个差异表达蛋白进行了蛋白互作用分析。此外,对其中5个比较重要蛋白的mRNA水平进行了荧光定量PCR分析,其表达变化与2-DE结果一致。本研究为进一步分析EIAV与其宿主细胞eMDM的相互作用提供了参考。