慢病毒与microRNA研究进展

正MicroRNA (miRNA)作为一类重要的调控分子广泛存在于动植物体内并且对调控基因表达有着重要的作用。mi RNA是一类高度保守且长度为18～25个核苷酸(nt)的小分子,它不编码蛋白质但却可以通过与蛋白编码基因的m RNA互补结合调控基因的表达。在植物中,通过完全配对结合靶基因而裂解靶m RNA;动物中,通过与靶基因不完全配对结合而抑制蛋白质的翻译。1993年首次在线虫体内发现mi RNA编码基因-lin-4基因,其编码的22 nt     

稳定表达人、马Tetherin蛋白的MDCK细胞系的构建及其限制流感病毒活性的研究

为评估人、马Tetherin(hu Tetherin、eq Tetherin)限制流感病毒的活性,本研究将huTetherin、eqTetherin克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,分别构建重组质粒pLPCX-HA-hu Tetherin、pLPCX-HA-eqTetherin,并构建pLPCX-HA作为阴性对照。将上述构建的重组质粒,pVSV-G以及pcGP共转染293T细胞,获得假病毒后感染MDCK细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立稳定表达huTetherin和eqTetherin的MDCK细胞系。经western blot鉴定显示,该细胞系中huTetherin和eqTetherin可稳定表达。以反向遗传救获的马流感病毒(A/equine/Jilin/1/1989)(JL89)感染这两种细胞系,结果显示eqTetherin和huTetherin均对该流感病毒株具有显著限制作用。该研究为进一步评价和探索huTetherin和eqTetherin限制流感病毒的作用和机制奠定了基础。     

2018年国际马传染病疫情动态

2018年生效的《OIE疫病感染及侵染名录》中包括11种马传染病。根据世界动物卫生组织(OIE)官方发布的疫情通报,主要参考疫病信息周报(Week ly disease information)、及时通报和跟踪报道(Imme diate notifications and follow-ups)检索项中的信息[1],并参考2018年及以前国际马传染病疫情动态,对收录于OIE疫病目录中的马传染性疾病在2018年的疫情动态进行了全面回顾[2],并按病毒、细菌和寄生虫性传染病分类总结如下.     

2013年国际马传染病疫情动态

根据世界动物卫生组织(OIE)官方发布的疫情通报,主要是参考疫病信息周报(Weekly Disease Information)和及时通报与跟踪报道(Immediate notifications and follow-ups)检索项中的信息[1-2],对OIE疫病目录中列入的马传染性疾病在2013年世界范围内的疫情动态进行了全面回顾,并按病毒、细菌和寄生虫性传染病分类总结.     

EIAV Rev蛋白拮抗eqTRIM5α介导的AP-1信号通路的机制研究

为探究马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev负调控Tripartite motif-containing protein 5α(TRIM5α)介导的AP-1信号通路的机制,本研究将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TRIM5α基因的质粒及pGL3-AP-1-Luc(AP-1报告质粒)共转染HEK 293T细胞,采用荧光素酶试验检测Rev对TRIM5α激活的AP-1信号通路的影响;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TAK1、TAB2、P38和c-Jun基因的质粒及pGL3-AP-1-Luc共转染HEK 293T细胞,采用荧光素酶试验检测Rev对TRIM5α下游转导分子(TAK1、TAB2、P38、c-Jun)激活的AP-1信号通路的影响;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含TAK1、TAB2、P38基因的质粒共转染HEK293T细胞,利用western blot试验分别检测TAK1、TAB2、P38的表达水平;将pEIAV-Rev-HA和pcDNA3.1质粒分别与含P38基因的质粒共转染HEK 293T细胞后加入蛋白酶体抑制剂MG132,利用western blot检测P38蛋白的表达情况。结果显示,共转染EIAV-Rev-HA实验组中TRIM5α对AP-1的激活倍数为0.4,而共转染pcDNA3.1对照组中相应的激活倍数为26.0;共转染pEIAV-Rev-HA实验组中,TAK1、TAB2、P38和c-Jun对AP-1信号通路的激活倍数分别为7.7、0.1、0.6、9.8,而共转染pcDNA3.1对照组中对AP-1信号通路的激活倍数分别为60.0、1.5、6.3、12.0;转染pEIAV-Rev-HA+pP38-Flag组与转染pcDNA3.1+pP38-Flag组相比,前者P38蛋白的表达量显著降低;加入蛋白酶体抑制剂组则恢复了P38蛋白的表达。上述结果表明,EIAV Rev显著下调eqTRIM5α及其下游转导分子TAK1、TAB2、P38激活的AP-1信号通路,但不显著下调c-Jun激活的AP-1信号通路;EIAV Rev通过蛋白酶体途径降解P38蛋白的表达而抑制eqTRIM5α激活的AP-1信号通路。本研究结果为理解EIAV与宿主蛋白相互作用提供参考依据。     

犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32（canis acidic （leucine-rich） nuclear phosphoprotein 32 ku,caANP32）对不同物种A型流感病毒（Influenza A virus,IAV） RNA 聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因（caANP32A、caANP32B及caANP32E）的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因（P＜0.05;P＜0.01）,在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因（P＜0.01;P＜0.05）,在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异（P>0.05）。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接变体：caANP32B_X1、caANP32B_X2和caANP32B_X3;caANP32E 基因具有2个不同剪接变体：caANP32E_X1和caANP32E_X2。通过分析ANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响发现,caANP32A和caANP32B均能支持犬流感病毒（H3N2_GD11）和马流感病毒（H3N8_JL89）RNA聚合酶活性,而对禽流感病毒（H9N2_ZJ12）RNA聚合酶活性支持较低。caANP32B_X2剪接变体对哺乳动物流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力显著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3（P＜0.05）;而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。【结论】本研究初步解析了caANP32家族蛋白的组织分布及序列多态性,阐明了其对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用,为解析MDCK细胞作为流感病毒分离和疫苗生产细胞系的分子机制提供了新的借鉴。     

感染马传染性贫血病毒的巨噬细胞差异表达microRNA分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染靶细胞-马单核巨噬细胞(eMDM)后细胞内microRNA (miRNA)表达的变化,本研究采用EIAV强毒株EIAVDLV34感染eMDM,并以未感染组作为对照,提取细胞内总RNA,通过高通量测序分析细胞内miRNA表达谱的变化。结果显示,与对照相比,感染EIAVDLV34后eMDM有16个miRNA发生差异表达,其中8个miRNA上调表达,8个miRNA下调表达,通过荧光定量PCR技术对这16个miRNA的表达进行了验证,结果与高通量测序一致,最后利用生物信息学方法对这16个miRNA的靶基因及其参与的生物学过程进行了分析,显示靶基因主要参与转录调控、信号转导、细胞凋亡等生物学过程。本研究为进一步分析EIAV与其宿主相互作用、致病机制以及慢病毒相关疾病的预防提供了参考依据。     

绿色荧光示踪马传染性贫血病毒样颗粒在活细胞中的组装过程

马传染性贫血病毒(EIAV)gag基因编码的多聚Gag蛋白能够自动组装形成病毒样颗粒(VLPs)。为研究EIAV衣壳蛋白合成、组装及释放过程,本实验通过构建表达EIAV Gag-GFP融合蛋白重组质粒,并将其转染293T细胞,采用western blot检测不同时间点VLPs的产生及释放。并进一步通过活细胞和3D成像技术观察Gag-GFP在细胞中的表达动态及VLPs的组装过程。结果表明:Gag和GFP蛋白融合表达不影响VLPs的组装,转染约6 h后EIAV Gag蛋白进行合成并在细胞胞质聚集完成组装形成VLPs。该实验结果为进一步研究EIAV在细胞中的组装路线和机制奠定了重要基础。     

我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究

本试验分别用马流感病毒吉林株、青海株和北京株人工感染ＳＰＦ鸡，通过ＨＩ价测定、临床观察，病毒分离以及病理观察，证明马流感病毒可在ＳＰＦ鸡体内激发短期的免疫应答，在各实质器官引起轻微的损害，但无明显临床症状，病毒分离阴性。