禽I型副粘病毒天鹅源分离株对鸡的致病性研究

为研究禽I型副粘病毒(APMV-1)天鹅分离株sw/CH/LHLJ/120608对鸡的致病性,本研究将该病毒以105EID50/m L的剂量,采用点眼和滴鼻的方式感染SPF鸡,检测其致病性,同时,采用荧光定量RT-PCR的方法检测病毒在各组织中的分布。结果显示,sw/CH/LHLJ/120608分离株感染鸡能够引起30%的发病率和6%的死亡率,并且病毒在感染鸡的呼吸系统、消化系统、免疫系统以及泌尿系统中均有广泛的分布。根据对APMV-1实验动物致病性的判定标准,该病毒株对鸡具有中等毒力的致病力特征。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

犬蝠源呼肠病毒的分离与鉴定

 【目的】从野生蝙蝠体内分离病毒，为开展蝙蝠的病原监测奠定基础。【方法】从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品，研磨后接种Vero E6细胞，从中分离到2株病毒，对其中一株病毒进行研究，使用生物学与分子生物学方法确定其分类学地位。【结果】该毒株在Vero E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变，表现为细胞内颗粒增多，细胞收缩、变圆，最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后，收集细胞及培养液，电镜观察发现，病毒粒子无囊膜，有双层衣壳，呈正二十面体对称，将病毒命名为Bat/China/2003（B/03）。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞，不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力、能耐受pH3.0的酸性环境、50℃水浴1 h病毒丧失感染能力、1 mol•L-1 MgCl2能提高病毒对热的抵抗力。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST分析表明，与呼肠病毒科正呼肠病毒属的Ndelle virus核苷酸同源性最高为91.2%。用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析，与哺乳动物呼肠病毒血清1、2、3型的代表株T1L，T2J，T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%。【结论】由以上结果推断该病毒为呼肠病毒科的成员。     

鸭肠炎病毒UL51和UL52基因的克隆及序列分析

利用靶基因步行 PCR 方法扩增得到鸭肠炎病毒(DEV Clone-03)5352 bp 基因片段,并进行克隆和测序.序列分析发现,该片段包含2个ORF.Blast 分析表明,这2个ORF分别与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL51 和UL52 基因同源,命名为DEV Clone-03 UL51和UL52,分别编码252和1124个氨基酸.DEV Clone-03 UL51和UL52基因排列方式与HSV-1同源基因相一致,为"头对头"的转录方向,两个ORF间有236 bp 间隔序列.用DNAStar(Megalign)软件分别对这2个ORF和11株α-疱疹病毒参考毒株进行分析,发现DEV Clone-03 UL51 与HSV-1的氨基酸序列有相对较高同源性,DEV Clone-03 UL52与EHV-4 同源性相对较高.并且DEV Clone-03UL51基因在α-疱疹病毒中比较保守.与HSV-1 UL52 蛋白相似,DEV Clone-03 UL52蛋白C末端存在锌指结构.系统发育分析表明,DEV Clone-03与α疱疹病毒亚科成员的关系比较保守,与Mardivims属的成员具有较近的亲缘关系.     

PP1和PP2对鸡传染性喉气管炎病毒感染影响的研究

为研究化学小分子SRC抑制剂PP1和PP2对鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染宿主细胞的影响,本研究将ILTV接种鸡细胞系LMH作为研究模型,检测了PP1和PP2对ILTV感染各阶段的作用。结晶紫染色结果显示,ILTV感染细胞中,与DMSO处理组相比,PP1和PP2处理组的细胞死亡均明显增多,表明PP1和PP2促进了ILTV感染介导的宿主细胞死亡;高内涵细胞筛选检测分析结果显示,在病毒感染24h时,PP1和PP2处理组EGFP荧光面积显著大于对照组(p<0.05),表明PP1和PP2可以促进ILTV的扩散,并且该现象不受ILTV中和抗体的影响,提示PP1和PP2可以促进ILTV的细胞-细胞间扩散;病毒特异性qPCR检测显示,PP1和PP2处理组的病毒基因组拷贝数与DMSO对照组相比无显著差异,PP1和PP2处理组之间的病毒基因组拷贝数也无显著差异(p>0.05),PP1和PP2对病毒复制无显著影响。为了进一步确定PP1和PP2促进ILTV细胞-细胞间扩散的具体作用方式,本研究利用多种颜色及理化性质不同的染料对LMH细胞膜、细胞质以及ILTV囊膜分别进行染色检测,结果显示PP1和PP2能够促进ILTV进入细胞,但对ILTV吸附细胞和细胞间胞质直接联系无显著影响。本研究初步确定了PP1和PP2影响ILTV感染的具体作用方式,为对其进一步分子机制研究奠定了基础。     

黑龙江省禽肉厂新城疫流行情况调查

通过对黑龙江省7个禽肉厂养禽场的饲养情况，疲劳免疫、消毒隔离措施及疫情发生情况进行调查，统计各禽肉厂新城疫疫情的流行情况，并对出口的18批次90栋舍540只宰前肉用禽类进行新城疫（NDV）血清血凝抑制抗体检测和病毒分离鉴定。共从12批次25栋舍87只肉用禽中分离出新城疫病毒，并对其中69株新城疫病毒进行毒力鉴定。均为中等以下毒力，来分离出强毒株。     

应用PCR检测鸭肠炎病毒弱毒在鸡胚体内的分布

根据GenBank已发表的鸭肠炎病毒（DEV）UL6基因的部分核苷酸序列，设计并合成一对引物．以鸭肠炎病毒中国商品化疫苗毒蚀斑纯化株（DEV Clone-03）DNA为模板，经PCR扩增出预期516bp的目的片段。将此片段插入克隆载体质粒pMD18-T，并进行序列测定，序列比较结果显示，此段序列与参考序列完全一致。用PCR检测DEV Clone-03在鸡胚体内的分布情况显示，接毒死亡鸡胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、肾和肌肉皮肤内均存在病毒。PCR敏感试验表明此方法可以检测到100μL尿囊液中提取的10^-3稀释的病毒DNA，相当于0．2个EID50病毒量的DNA。     

鸭肠炎病毒gL蛋白在鸡胚成纤维细胞中动态表达的检测

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。     

抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为鉴定鸡传染性支气管炎病毒(IBV)抗原表位,本研究将IBV tl/CH/LDT3/03株免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆筛选,得到两株针对IBV核(N)蛋白的单克隆抗体(MAb)6H3和6F9,其染色体数目分别为90条和102条,MAb亚类鉴定分别属于IgG1和IgG2b,轻链均为κ链。对MAb6H3和6F9的抗原表位进行初步鉴定,将N基因分成8个片段克隆于pGEX-6p-1载体中,转化BL21(DE3)内诱导表达。经western blot分析,MAb6H3表位的初步定位在aa80～aa99,而MAb6F9表位的初步定位在aa64～aa82。而且MAb6F9还能特异性识别其他5株IBV的天然N蛋白,推测它们含有一个相同的B细胞表位。     

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LSD/05 Ⅰ的分离、鉴定及弱毒疫苗对气管的保护

从2005~2006年中国部分地区鸡场疑似鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)感染鸡分离到12株鸡传染性支气管炎病毒,并对其部分生物学特性及基因型进行了研究。发现其中11株病毒分属于LX4和CK/CH/LSC/99Ⅰ型。通过S1基因比较、进化树分析、BLAST搜寻和动物试验研究发现,CK/CH/LSD/05Ⅰ是一株新型变异毒株。动物感染试验表明,CK/CH/LSD/05Ⅰ感染鸡的肾脏病变不明显,仅有20%的感染鸡肾脏病毒分离呈阳性,但100%感染鸡呼吸道病毒分离阳性,表明该病毒不是中国普遍流行的肾型毒株,而其对呼吸道具有较强嗜性。同时,实验应用弱毒疫苗H120和本实验室致弱的3株异种毒株进行了动物保护试验,结果显示,用CK/CH/LSD/05Ⅰ攻毒后,这4株异种传染性支气管炎病毒的免疫对气管的保护率很低。初步揭示该毒株可能属新的血清型病毒。