Hippo信号通道中Lats2基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系

[目的]探究Hippo信号通道中Lats2基因与湖羊肌肉生长发育的关联性。[方法]以湖羊作为试验材料,用RT-qPCR技术分析Lats2基因在不同性别、不同生长阶段(2、60、180日龄)、不同肌肉组织(比目鱼肌、背最长肌、腓肠肌和趾长伸肌)的时空表达规律,及其与Lats1、YAP1(Yes相关蛋白1)基因和肌肉生长相关基因在不同生长阶段的相关性。[结果]根据Hippo信号通道中Lats2基因的时空表达规律可以发现:在不同肌肉组织中,Lats2基因在趾长伸肌中相对表达量最高;在不同生长阶段,Lats2基因在60日龄的表达量最高;在不同性别中,Lats2基因的表达表现为公羊高于母羊。相关性分析结果表明:在2日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MSTN基因间正相关(P0.05);在60日龄的肌肉组织中,Lats2基因的表达与Lats1基因正相关(P0.05);在180日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MyoG基因间极显著正相关(P0.01),与YAP1基因间显著负相关(P0.05)。[结论]Hippo信号通道中Lats2基因的表达受不同性别、年龄和肌肉组织的影响,可能通过下调YAP1基因的表达抑制肌肉生长发育,可作为肌肉生长发育调控研究的候选基因。     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。     

蛋清内注射三碘甲腺原氨酸对鸭出雏前后生长发育、血清中甲状腺激素水平及肝脏中D1和D3表达的影响

【目的】以金定鸭为研究对象,孵化前向蛋清内注射三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine,T3）,检测鸭出雏前后体重、胸浅肌重、血清中甲状腺激素（thyroid hormones,THs）水平的变化,分析肝脏中I型脱碘酶（deiodinases I,D1）和Ⅲ型脱碘酶（deiodinasesⅢ,D3）mRNA表达、蛋白水平及酶活性的变化,探究外源性T3对鸭出雏前后生长发育及肝脏中脱碘酶表达的影响。【方法】将200枚金定鸭种蛋随机分为对照组和试验组,在孵化前从蛋的锐端往试验组种蛋蛋清内注射100 μL含250 ng T3的生理盐水,对照组注射不含T3的100 μL生理盐水,两组种蛋在相同条件下同期孵化。在27胚龄和7日龄时,记录鸭的体重和胸浅肌重,采用放射免疫分析法检测鸭血清中T3和四碘甲腺原氨酸（thyroxine,T4）水平,利用实时荧光定量PCR检测鸭肝脏中D1和D3的mRNA表达,利用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测鸭肝脏中D1和D3蛋白水平及酶活性。【结果】在27胚龄和7日龄时试验组鸭的体重（P = 0.035,0.044）和胸浅肌重（P = 0.027,0.037）均显著高于对照组;试验组血清中T3和T4水平在27胚龄时与对照组之间差异不显著（P > 0.05）,而7日龄时均显著低于对照组（P = 0.040,0.040）;试验组鸭肝脏中脱碘酶mRNA表达量仅D3在7日龄时显著低于对照组（P = 0.040）;在7日龄时试验组鸭肝脏中D1和D3的蛋白含量和酶活性亦均显著低于对照组（P = 0.017,0.045;P = 0.013,0.039）。鸭出雏前后的胸浅肌重与血清中T3水平呈强的负线性相关（r = -0.431,P = 0.025）;血清中T3水平与肝脏中D3的mRNA表达呈极显著正向相关（r = 0.778,P = 0.005）,血清中T4水平与D1和D3的蛋白水平和酶活性均呈正线性相关（r = 0.685,P = 0.020;r = 0.662,P = 0.026;r = 0.710,P = 0.014;r = 0.705,P = 0.015）。【结论】蛋清内注射T3促进了鸭出雏前后生长发育,同时伴随着出雏后循环中THs水平的降低,肝脏中D1和D3的表达发生下调。     

湖羊羔皮候选基因在不同花纹间的表达与毛囊发育特性关联的研究

【目的】研究5个候选基因在不同花纹组间的表达量与毛囊各指标的相关性,进一步了解候选基因与毛囊发育特性间的关联,筛选用于后期功能验证的基因。【方法】利用荧光定量PCR技术检测5个基因在不同组别间的表达量,结合组织学与显微观测技术,分析5个基因与毛囊发育间的关联。【结果】湖羊毛囊成群分布,湖羊大花、小花、中花多以3毛囊群居多,直径较大的为中心初级毛囊,直径相对较小的为侧部初级毛囊。湖羊大花与中花、小花初级毛囊直径呈极显著差异（P＜0.01）,小花与中花初级毛囊直径差异不显著（P＞0.05）。中花次级毛囊直径与大花、小花次级毛囊直径呈极显著差异（P＜0.01）,但小花次级毛囊直径与大花次级毛囊直径差异不显著（P＞0.05）。初级毛囊数大花、中花、小花间差异均不显著（P＞0.05）,但相同视野中大花初级毛囊数多于中花、小花。中花次级毛囊数与大花、小花次级毛囊数呈极显著差异（P＜0.01）,但大花、小花次级毛囊数差异不显著（P＞0.05）;MMP2基因在中花皮肤组织中的表达量与大花、小花分别呈极显著差异（P＜0.01）,在大花皮肤组织中的表达量与小花差异不显著（P＞0.05）;BMP7基因在大花皮肤组织中的表达量与小花呈显著差异（P ＜0.05）,在中花皮肤组织中的表达量与大花、小花分别差异不显著（P＞0.05）;SFXN1基因在小花皮肤中的表达量与大花、中花分别呈显著差异（P＜0.05）,在大花皮肤组织中的表达量与中花差异不显著（P＞0.05）。其余基因在3组个体间差异不显著;MMP2基因相对表达量与大花次级毛囊数呈显著正相关（P＜0.05）。BMP7基因相对表达量与小花初级毛囊直径呈显著正相关（P＜0.05）,与小花次级毛囊数呈极显著正相关（P＜0.01）,与中花初级毛囊直径、次级毛囊数呈显著负相关（P＜0.05）;SFXN1基因相对表达量与大花初级毛囊呈显著负相关（P＜0.05）,与小花初级毛囊直径、小花次级毛囊直径分别呈显著正相关及极显著正相关,与中花初级毛囊直径呈极显著负相关。在BMP7基因表达量相同情况下,小花初级毛囊直径比中花初级毛囊直径大,小花次级毛囊数比中花次级毛囊数多,这与切片结果相符。MMP2基因在表达量相同情况下大花毛囊数多于小花,中花最少,这与切片结果一致。此外,在SFXN1基因表达量相同情况下,小花毛囊直径最大,大花次之,中花最小,这虽与切片结果不相符,但大花、小花次级毛囊数相差很小,总体来说趋势相同,结果基本相符。其余基因虽与毛囊相关指标存在关联,但在大中小花组表达差异不显著,【结论】BMP7、MMP2、SFXN1三个基因可作为湖羊早期羔皮选育的重要候选基因。     

湖羊羔皮毛囊候选miRNA在不同花纹间的表达与毛囊发育特性关联的研究

【目的】通过前期高通量测序技术结合生物信息学分析研究湖羊大花、中花和小花羔皮毛囊间miRNA的差异表达,筛选出了14个候选miRNA,现进一步研究14个候选miRNA在不同花纹组间的表达量与毛囊各指标的相关性,以了解候选miRNA与毛囊发育特性间的关联,筛选用于后期功能验证的miRNA。【方法】利用高通量测序技术筛选湖羊大花、中花、小花不同花纹羔皮毛囊中的差异表达miRNA。利用与高通量测序同一批样品所提取的RNA进行RT-RCR验证,随机选取高通量测序结果中的5个差异表达miRNA,验证高通量测序结果的可靠性。通过荧光定量PCR技术检测14个候选miRNA在不同组别间的表达量,制作不同花纹羔皮组织的石蜡切片以评估不同毛囊的结构,并结合组织学观察与显微观测技术,采用SPSS 17.0分析14个候选miRNA的表达水平与毛囊组织学性质的相关性。【结果】湖羊毛囊成群分布,以3毛囊群的居多,直径较大的为中心初级毛囊,直径较小的为侧部次级毛囊。在显微镜相同视野中,湖羊大花、中花和小花3种不同类型花纹羔皮的初级毛囊数差异不显著（P＞0.05）,小花组的次级毛囊数多于大花组和中花组的次级毛囊数且差异极显著（P＜0.01）,中花组与小花组二者次级毛囊数相仿,差异不显著（P＞0.05）,在相同的单位面积中,小花的毛囊总数要高于大花组和中花组;大花组的初级毛囊直径比中花组和小花组的初级毛囊直径要大的多,与中花组和小花组的初级毛囊直径差异极显著（P＜0.01）,大花组的次级毛囊直径也比中花组、小花组的次级毛囊直径大,同时也与二者均呈极显著差异（P＜0.01）,中花组和小花组二者的初级毛囊直径以及次级毛囊直径均差异不显著（P＞0.05）;在已知的miRNA中,miRNA-143在大花组中的表达量与小花组差异极显著（P＜0.01）,miRNA-10a在小花组的表达量与大花和中花组差异显著（P＜0.05）,let-7i在大花组的表达量与中花组差异显著（P＜0.05）;在测序新预测的差异miRNA中,NW_004080184.1_6326在中花组的表达量与大花组差异显著（P＜0.05）、与小花组差异极显著（P＜0.01）,NW_004080165.1_8572在中花组的表达量与大花组和小花组差异极显著（P＜0.01）,NW_004080181.1_3961在中花组的表达量与小花组差异极显著（P＜0.01）,NW_004080190.1_13733在中花组的表达量与大花组差异极显著（P＜0.01）,其余miRNA在大、中、小花中的表达差异不显著。14个miRNA的相对表达量均与毛囊部分指标存在相关性,表明I4个miRNA均有可能参与毛囊的生长发育。【结论】 miRNA-143、miRNA-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961以及NW_004080190.1_13733 等7个miRNA可作为对湖羊羔皮毛囊发育具有重要影响的候选miRNA,在后续试验中将进一步验证。     

罗伊氏乳杆菌I5007对新生仔猪肠道形态、二糖酶活性和紧密连接蛋白表达的影响

【目的】罗伊氏乳酸杆菌是普遍存在于人和动物肠道的有益乳酸杆菌,研究表明,口服罗伊氏乳酸杆菌能显著降低腹泻的发病率和严重程度。研究罗伊氏乳酸杆菌I5007（Lactobacillus reuteri I5007）对新生仔猪肠绒毛发育和肠黏膜屏障功能的影响。【方法】试验选取9窝1日龄的杜×长×大初生仔猪,每窝挑选8头体重相近、出生状况良好的仔猪,按体重分为3组,每组3窝仔猪。即：对照组（灌服0.1%无菌蛋白胨溶液）,前4日龄灌服组（1-4 d,每日每头灌服活菌总数为1.2×10¹⁰ CFU 的L. reuteri I5007）和隔4日龄灌服组（1、5、9、13、17和21 d灌服,灌服剂量同前4日龄灌服组）。试验期21 d,试验期间仔猪由各自母猪哺乳饲喂。于试验第7、14和21 天,每个处理组随机选取4头仔猪,空腹称重、麻醉和屠宰,截取相同位置的十二指肠、空肠和回肠,测定其肠绒毛形态,并测定试验结束时（21 d）空肠和回肠二糖酶活性和紧密连接（TJ）蛋白的表达。【结果】灌服L. reuteri I5007对仔猪生长性能没有显著影响（P＞0.05）,但对不同阶段仔猪的肠道形态有不同程度的影响。7 d时,隔4日龄灌服组与对照组相比,仔猪十二指肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度、杯状细胞数和回肠杯状细胞数均显著增加（P＜0.05）,前4日龄灌服组仔猪的十二指肠绒毛高度/隐窝深度、杯状细胞数和回肠杯状细胞数也均显著高于对照组仔猪（P＜0.05）,但对十二指肠绒毛高度无显著影响（P＞0.05）;14 d时,隔4日龄灌服组仔猪十二指肠的绒毛高度/隐窝深度和回肠杯状细胞数均显著高于对照组（P＜0.05）,前4日龄灌服组仔猪的回肠杯状细胞数也显著高于对照组（P＜0.05）,但却低于隔4日龄灌服组（P＜0.05）;21 d时,隔4日龄灌服组显著提高了仔猪十二指肠和回肠的杯状细胞数（P＜0.05）,前4日龄灌服组与对照组相比,仅提高了回肠杯状细胞数（P＜0.05）,反而降低了十二指肠绒毛高度/隐窝深度（P＜0.05）。另外,前4日龄灌服组仔猪空肠隐窝深度显著低于隔4日龄灌服组仔猪（P＜0.05）,但其十二指肠杯状细胞数和绒毛高度/隐窝深度均显著低于隔4日龄灌服组仔猪（P＜0.05）。在二糖酶活性上,隔4日龄灌服组仔猪空肠蔗糖酶和麦芽糖酶活性均显著高于对照组（P＜0.05）,前4日龄灌服组仅提高了仔猪空肠麦芽糖酶活性（P＜0.05）,且该组空肠蔗糖酶活性和麦芽糖酶活性均显著低于隔4日龄灌服组（P＜0.05）。隔4日龄灌服组对仔猪空肠和回肠的3种TJ蛋白（Claudin-1、Occludin和ZO-1）均有显著的促表达作用（P＜0.05）,前4日龄灌服组仔猪空肠Claudin-1、ZO-1和回肠Claudin-1的表达也均高于对照组（P＜0.05）,但是其空肠Occludin显著低于隔4日龄灌服组（P＜0.05）,且其回肠Claudin-1（P = 0.1）和ZO-1（P = 0.1）相比于隔4日龄灌服组也有降低的趋势。【结论】本试验条件下,新生仔猪隔4日龄灌服L. reuteri I5007（1.2×10¹⁰ CFU/头/日）,能有效促进仔猪肠绒毛发育,提高空肠二糖酶活性,促进仔猪肠上皮细胞TJ蛋白的表达,在改善新生仔猪的肠黏膜屏障功能中可能起到一定的作用。     

放牧与舍饲条件下山羊肌肉发育和抗氧化能力变化研究

【目的】探究在放牧、舍饲条件下幼龄山羊肌肉品质及抗氧化能力的发育性变化。【方法】选择体况良好、体重相近的经产湘东黑山羊母羊25头,进行同期发情处理,怀孕后产羔,获得36头羔羊,不记公母。出生后20 d内所有羔羊均仅喂以母乳。在0、7、14 d,每个时间点分别随机选取4头屠宰;21 d时,将剩余的24头羔羊随机分为放牧组和舍饲组,每组12头,除母乳外,放牧组以牧草为食,舍饲组补给精料及与放牧组相同的牧草,40 d断奶;在42、56、70 d时,两组每个时间点分别随机选取4头进行屠宰。称量宰前活重、胴体重,采集背最长肌,测定肌肉中粗蛋白（CP）、肌内脂肪（IMF）、氨基酸（AA）、脂肪酸（FA）的组成和含量及主要抗氧化酶活性,包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（GSH）和总抗氧化能力（T-AOC）。【结果】（1）羔羊宰前活重、胴体重随日龄显著增加（P＜0.05）,相较于舍饲羊,放牧羊宰前活重较低（P＞0.05）,但胴体重较高（P＞0.05）。（2）无论是放牧还是舍饲,肌肉干物质中CP水平随日龄呈线性增加趋势（P＜0.05）,IMF含量呈升高趋势（P＞0.05）;相较于舍饲羊,放牧羊CP水平较低（P＞0.05）,IMF含量明显较高（P＜0.05）。（3）肌肉中氨基酸总量（TAA）、成人必需氨基酸（AEAA）、婴儿必需氨基酸（BEAA）在不同日龄间没有显著差异（P＞0.05）,但TAA随日龄有升高趋势（P＞0.05）,鲜味氨基酸（FAA）随日龄呈显著增加趋势（P＜0.05）;相较于舍饲羊,放牧羊TAA、AEAA、FAA含量较低,BEAA则较高,但均差异不显著（P＞0.05）。（4）肌肉中饱和脂肪酸（SFA）在放牧条件下随日龄变化不显著（P＞0.05）,舍饲时呈二次曲线变化（P＜0.05）,单不饱和脂肪酸（MUFA）显著降低（P＜0.05）,多不饱和脂肪酸（PUFA）、必需脂肪酸（EFA）显著升高（P＜0.05）;与舍饲羊相比,放牧羊SFA、PUFA、EFA比例较低（P＞0.05）,MUFA较高（P＜0.05）。（5）随着年龄的增长,CAT、SOD活力在0-14 d呈升高趋势,14-42 d有所降低,之后继续呈增加趋势,整体变化不显著（P＞0.05）,GSH-Px活力呈显著性二次曲线变化（P＜0.05）,T-AOC呈升高趋势（P＜0.05）,GSH含量在放牧组呈线性降低趋势（P＜0.05）,在舍饲组变化不显著（P＞0.05）;相较于舍饲羊,放牧羊SOD、GSH-Px、T-AOC活力较高（P＞0.05）,CAT活力较低（P＞0.05）,GSH含量则显著较低（P＜0.05）。【结论】随着年龄的增长,山羊宰前活重、胴体重显著增加,但饲养方式（放牧、舍饲）对其影响不显著,而肌肉中CP水平逐渐增加,IMF沉积呈升高趋势,氨基酸、脂肪酸的组成一致,含量有差异,相应指标是舍饲羊优于放牧羊。整体来看,舍饲羊肉质稍优于放牧羊。但山羊肌肉抗氧化能力随日龄逐渐增强,且放牧羊高于补饲羊。因此,根据当地和养殖场的条件,以及幼龄山羊肉质阶段性发育规律,合理选择放牧、舍饲等饲养方式,如可以将二者结合或轮换等,以获得更好的肉质和更大的经济效益。     

油脂来源及使用量对小鼠生长、健康、血脂和肝脏胆固醇代谢指标的影响

【目的】观察饲料中添加不同种类和不同剂量的油脂对小鼠生长性能、健康状态、血脂指标和肝脏胆固醇代谢关键基因相对表达量的影响,探讨日粮中不同油脂来源及使用量对肝脏胆固醇代谢的作用机制,为哺乳动物筛选较为适宜的油脂类型及其添加量提供理论参考。【方法】试验选取3周龄体重16-19 g的健康昆明种小鼠48只,随机分为4组,每组4个重复,每个重复3只。4组分别饲喂正常小鼠饲料（对照组）和添加4%豆油（B组）、4%乳化椰子粉（L组）以及8%乳化椰子粉（H组）的饲料14 d。试验期间,记录每天的饲喂次数、每次饲喂量、饲料剩余量,所有试验动物均自由采食和饮水。分析试验期间小鼠的体重变化和平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）等生长性能指标,分析小鼠的血液分布和健康指数等健康状态指标,测定小鼠的肝脏重以及甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等血清脂质指标,运用实时荧光定量PCR技术检测小鼠肝脏组织中胆固醇7-α羟化酶（CYP7A1）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）这3个基因的mRNA表达水平。【结果】①生长性能方面,添加4%豆油组的小鼠体重变化、平均日采食量和肝脏脏器指数与对照组差异显著（P＜0.05）,而平均日增重、料重比和肝脏重与对照组差异不显著（P＞0.05）;添加4%乳化椰子粉组的小鼠各生长性能指标与对照组差异不显著（P＞0.05）;8%乳化椰子粉显著提高小鼠的平均日采食量（P＜0.05）,其他指标差异不显著（P＞0.05）。②健康状态方面,各试验组小鼠的血液分布和健康指数与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。③血脂指标方面,与对照组相比,添加4%豆油显著降低了小鼠血清中TC和HDL-C含量（P＜0.05）,对TG和LDL-C的影响差异不显著（P＞0.05）,添加4%乳化椰子粉对小鼠的各项血脂指标均无显著性影响（P＞0.05）,添加8%乳化椰子粉能显著降低血清TC含量（P＜0.05）,但对TG、HDL-C和LDL-C无显著性影响（P＞0.05）;④肝脏胆固醇相关基因方面,添加8%乳化椰子粉组肝脏中CYP7A1基因mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05）,而4%豆油组和4%乳化椰子粉组与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。肝脏HMGCR基因和LDLR基因mRNA表达水平与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】日粮中添加豆油增加了小鼠日采食量和体重等指标,降低了血清总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇;高剂量乳化椰子粉的添加提高了小鼠日采食量,降低了血清总胆固醇,并增加了肝脏CYP7A1基因mRNA的表达。相比于添加高剂量乳化椰子粉,低剂量乳化椰子粉在改善小鼠脂代谢方面应用效果并不好。添加油脂可能是通过调控肝脏中胆固醇代谢相关酶的基因表达量来影响小鼠肝脏胆固醇的代谢,从而维持体内的胆固醇代谢的稳态。     

Arkadia和UCH37表达载体的构建及其对TGF-β1/Smads信号通路的影响

【目的】构建泛素启动酶Arkadia和泛素羧基末端水解酶-5（亦称UCH37）的表达载体,并探讨Smad7蛋白的泛素化修饰对马兜铃酸肾病中TGF-β1/Smads信号通路的影响。【方法】通过观察绿色荧光的表达量及real-time PCR反应优化转染条件,转染Arkadia和UCH37 siRNA,real-time PCR检测mRNA表达抑制率。分别构建Arkadia和UCH37的表达载体pGPU6/GFP/Neo,经鉴定后转染细胞,real-time PCR和Western blotting检测Arkadia、UCH37和Smad7的表达变化。【结果】①30 pmol siRNA和1.5 μL LipofectamineTM 2000为最佳转染条件;②Arkadia-1490和UCH37-721的干扰效果最明显;③载体的插入序列完全正确,且pGPU6/GFP/Neo-Arkadia能上调马兜铃酸肾病模型中Smad7的表达,而pGPU6/GFP/Neo-UCH37使Smad7表达下降。【结论】成功构建了表达载体pGPU6/GFP/Neo-Arkadia和pGPU6/GFP/Neo-UCH37,且Arkadia和UCH37可分别放大、抑制TGF-β1/Smads信号通路。     

断奶时间对羔羊生长性能和器官发育及血清学指标的影响

【目的】研究不同断奶日龄对羔羊断奶后10d的生长、营养物质消化、器官发育和血清指标的影响,筛选羔羊最佳的早期断奶日龄。【方法】选取出生日龄、体重相近的湖羊羔羊72只,分成4组。3个试验组每组16只,分别于羔羊10、20、30日龄进行断奶,饲喂代乳品（EW10组、EW20组、EW30组）;对照组24只（ER组）,羔羊随母哺乳。试验组羔羊于断奶后10d内进行消化试验,并在断奶后10d时测定羔羊生长性能、器官发育情况和血清指标变化规律,并以对照组作相同处理作为对照。【结果】（1）断奶后10d时,EW10和EW30羔羊体重、日增重显著低于ER（P＜0.05）,而EW20羔羊体重、日增重与ER差异不显著（P＞0.05）。EW10和EW20组断奶后10d内羔羊开食料干物质采食量显著高于ER组（P＜0.05）,EW30与ER组差异不显著（P＞0.05）。（2）EW10组羔羊断奶后10d内干物质（DM）和有机物（OM）的消化率与ER差异不显著（P＞0.05）,总能（GE）、氮（N）、粗脂肪（EE）、钙（Ca）和磷（P）的表观消化率显著低于ER组（P＜0.05）。EW20和EW30组羔羊断奶后10内DM、OM、GE、N、EE、Ca和P的表观消化率显著低于ER组（P＜0.05）。（3）羔羊断奶后10d时EW10组瘤胃占羔羊体重比值显著高于ER（P＜0.05）,EW20和EW30组与ER组相比差异不显著,但均高于ER组。其余指标或组别均差异不显著（P＞0.05）。（4）早期断奶羔羊各血清指标在断奶当天与对照组差异不显著（P＞0.05）。EW10和EW30组羔羊断奶后10d血清中TP和ALB含量显著低于ER（P＜0.05）,EW10羔羊于断奶后10d血清中TNF-α显著高于ER（P＜0.05）,EW10和EW30羔羊断奶后10d血清中CORT显著高于ER（P＜0.05）。【结论】羔羊20日龄断奶后10d应激较小,此日龄断奶效果较佳。     

湖羊GHR和IGF-Ⅰ基因表达的发育性变化 及其与肉质性状的关联

 【目的】探讨生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）和胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ）基因在湖羊不同生长阶段背最长肌中表达丰度与肉质性能的相关性以及这两个基因表达水平的关联性,为湖羊肌肉生长性状的选育提供遗传学资料。【方法】利用荧光定量RT-PCR分析GHR和IGF-Ⅰ基因在湖羊早期生长背最长肌肉组织中的mRNA的发育性变化。【结果】①出生后随着月龄的增加,母羊GHR基因在背最长肌的表达趋势为：先升高后降低再升高再降低最后再升高,最后6月龄到达最高点;公羊GHR在背最长肌的表达趋势为：先升高到2月龄到达一个峰值,2月龄到4月龄为一个降低的过程,4月龄到6月龄又升高,并到达最高点;母羊IGF-Ⅰ基因在背最长肌的表达趋势为：由2日龄开始依次升高最后于6月龄到达最高点;公羊IGF-Ⅰ基因在背最长肌的表达趋势为：先升高到1月龄到达一个峰值,1月龄到3月龄为一个降低的过程,并于3月龄降至与初生接近相等的水平,此后随月龄增加逐渐升高,并于6月龄到达最高点;②GHR和IGF-Ⅰ基因在湖羊各月龄间大多存在显著或极显著差异,湖羊的公羊和母羊的GHR和IGF-Ⅰ基因的相同生长阶段的表达也大多存在显著或极显著差异;③GHR和IGF-Ⅰ基因的表达存在显著正相关（0.01＜P＜0.05）,GHRI和GF-I基因与肌纤维直径均存在极显著正相关（P＜0.01）,GHR与肌纤剪切力存在极显著正相关（P＜0.01）,IGF-Ⅰ与肌纤剪切力存在显著正相关（0.01＜P＜0.05）,GHR和IGF-Ⅰ基因与肌纤维密度均存在极显著负相关（P＜0.01）。【结论】性别和年龄对于GHR和IGF-Ⅰ基因在湖羊不同生长阶段的肌肉中的表达具有重要影响;出生后,各基因表达水平并非随之上升或者下降,各基因表达水平出现拐点的时间并不相同;GHR和IGF-Ⅰ基因在湖羊早期肌肉性状的表达为显著正相关,可以作为湖羊早期肉质性状的候选基因。     

湖羊TGF-β1基因特征、表达及其与排卵数的相关性分析

【目的】获取湖羊TGF-β1基因序列,了解TGF-β1序列特征和组织表达特征,分析卵巢组织中TGF-β1基因表达水平与排卵数之间的关系。【方法】通过PCR扩增和测序获得湖羊TGF-β1基因序列,并采用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析湖羊TGF-β1基因的组织表达特征;采用Real-time qPCR方法分析多羔组与单羔组湖羊卵巢组织TGF-β1基因表达水平的差异,及其与排卵数之间的关系。【结果】湖羊TGF-β1基因编码区序列全长1 173 bp,编码蛋白含有390个氨基酸残基,包含典型的TGF-β前肽和TGF-β like等结构域。TGF-β1基因在湖羊卵巢组织中高表达,多羔组卵巢组织中TGF-β1基因表达水平显著高于单羔组（P＜0.05）,且表达水平与排卵数呈极显著正相关（P＜0.01）。【结论】多羔组湖羊卵巢组织TGF-β1基因表达水平显著高于单羔组,且与排卵数间呈极显著正相关,推测TGF-β1基因在湖羊卵泡发育、成熟或排卵过程中发挥重要作用,是影响湖羊高繁殖力的候选基因。     

青山羊表皮生长因子基因表达与毛囊发育特性的研究

【目的】比较研究表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）基因的表达与青山羊皮肤毛囊发育之间的关系。【方法】用组织学技术和显微观测的方法,研究济宁青山羊1日龄、1-5月龄,共6个年龄段的皮肤毛囊的组织学特性,结合荧光定量PCR技术,研究其与EGF基因表达之间的关系,并用SAS9.0软件进行相关性分析。【结果】初级毛囊直径在出生后随日龄稍有增大,但差异不显著（P＞0.05）,而次级毛囊直径在2月龄之前极显著增大（P＜0.01）,达到发育高峰,之后保持相对稳定。EGF基因在出生后表达量极显著升高（P＜0.01）,在2月龄达到最高,之后表达量极显著减少（P＜0.01）。【结论】初级毛囊在出生前就已全部发育形成,而次级毛囊在出生后可继续发育至2月龄。自出生至2月龄,EGF表达量与次级毛囊直径呈极显著正相关（P＜0.01）。     

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。     

牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达

【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418 筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高（P＜0.01）,肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高（P＜0.01）。细胞形态观察显示成肌细胞融合为肌管。【结论】构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成肌细胞中高效表达,myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。     

湖羊BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因mRNA表达水平与排卵数关系的研究

 【目的】研究湖羊卵巢组织BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因mRNA表达水平与排卵数的相关性,筛选影响湖羊多胎性状的候选基因,为揭示湖羊高繁多胎分子遗传机理提供参考。【方法】选取16只经产湖羊母羊,分为产单羔组和多羔组,发情后24～36 h屠宰,取卵巢,计数排卵点,记录排卵数;应用RT-PCR技术检测BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因的组织表达特征,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析各基因mRNA在单羔组和多羔组卵巢组织中的表达差异。【结果】BMP2、BMP4和BMP7基因在湖羊母羊卵巢组织内表达,而且在垂体及下丘脑、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、输卵管组织中均有表达;BMP6基因仅在湖羊母羊卵巢、肾脏、肌肉和输卵管组织中表达。在卵巢组织,多羔组排卵数极显著高于单羔组（P＜0.01）,且多羔组BMP4基因mRNA表达极显著高于单羔组（P＜0.01）,而BMP2、BMP6和BMP7基因mRNA表达在单羔组和多羔组间无显著差异（P＞0.05）;相关分析表明在卵巢组织中,只有BMP4基因mRNA表达与排卵数呈正相关(r = 0.741,P ＜0.05)。【结论】BMP4基因mRNA表达在单羔组和多羔组间差异显著,可能对湖羊排卵数起关键作用,是影响湖羊排卵数的候选基因。     

5-HT及5-HT1A受体在不同妊娠阶段大鼠子宫中的分布

 【目的】研究5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）及5-HT1A受体在SD大鼠妊娠期子宫中的分布情况和变化规律。【方法】选取均为正常妊娠的30 只雌性SD大鼠分为妊娠3 d、妊娠5 d、妊娠7 d、妊娠13 d、妊娠19 d及产后第1天6组,处死各组大鼠,取子宫制作石蜡切片,经免疫组织化学SP 法染色后,进行观察分析。【结果】5-HT及5-HT1A受体免疫阳性产物广泛存在于子宫内膜上皮细胞、子宫腺上皮细胞、血管内皮细胞、基质细胞、蜕膜细胞、免疫细胞及肌纤维中;5-HT在妊娠7 d和妊娠13 d着色最深,5-HT1A受体在妊娠13 d着色最深。5-HT及5-HT1A受体免疫阳性产物相对表达量的T检验表明,子宫内膜5-HT在妊娠7 d和妊娠13 d的表达较妊娠3 d、妊娠5 d和产后极显著的增加（P＜0.01）,较妊娠19 d显著增加（P＜0.05）;子宫肌层5-HT在妊娠19 d的表达较妊娠7 d显著减少（P＜0.05）,较妊娠13 d极显著的减少（P＜0.01）。子宫内膜5-HT1A受体在妊娠13 d较妊娠3 d、妊娠5 d、妊娠19 d及产后极显著的增加（P＜0.01）,较妊娠7 d显著增加（P＜0.05）;子宫肌层5-HT1A受体在妊娠13 d较妊娠各个时期极显著增加（P＜0.01）。5-HT和5-HT1A受体在妊娠期子宫中的表达,具有极显著的正相关性。【结论】5-HT和5-HT1A受体在妊娠期子宫中的表达具有一定规律,5-HT通过5-HT1A受体参与妊娠的调节。     

17beta-雌二醇通过beta受体和cAMP-ERK1/2级联调节仔猪睾丸支持细胞cyclinA2 mRNA的表达

 【目的】确定雌激素是否通过雌激素受体以及在cAMP-细胞外调节的蛋白激酶（ERK1/2）调节培养条件下,未成熟仔猪睾丸支持细胞中cyclinA2 mRNA的表达。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加雌激素受体抑制剂以及各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR检测cyclinA2 mRNA的相对表达量。【结果】17beta-雌二醇（10-9 mol•L-1）以时间依赖的方式促进了cyclinA2 mRNA的表达（P＜0.05）,这一作用在30 min时到达到高峰。雌激素非特异性受体抑制剂ICI182780、雌激素受体beta抑制剂（ERbetaAnt）和雌激素受体alpha抑制剂（ERalphaAnt）单独作用对cyclinA2 mRNA的表达与空白对照相比没有显著影响（P＞0.05）,但ICI 182780与 ERbetaAnt,而不是ERalphaAnt抑制了17beta-雌二醇诱导的cyclinA2 mRNA的表达（P＜0.05）。17beta-雌二醇（10-9mol•L-1）和 forskolin均促进了cyclinA2 mRNA的表达（P＜0.05）,而Rp-cAMP、H-89和U0126都抑制了17beta-雌二醇（10-9mol•L-1）的活性（P＜0.05）,但3种抑制剂单独作用时对cyclinA2 mRNA的表达与空白相比没有显著影响（P＞0.05）。【结论】 17beta-雌二醇主要通过ERbeta受体、影响cAMP的产生和ERK1/2激活,进而调节cyclinA2 mRNA的表达。     

母鸡限饲对子代脂肪沉积、相关酶活性及其基因表达的影响

 【目的】本试验旨在研究母鸡采食量限饲对子代脂肪沉积、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)活性及其基因表达的影响,探讨母体营养效应及子代后天的补偿作用。【方法】选择东北农业大学繁育的高、低脂系肉种母鸡各384羽,分别分为两个处理组。产蛋期,处理一饲喂正常日粮,处理二日采食量是处理一的75%。产蛋高峰期收集种蛋进行孵化。子代自由采食常规水平日粮。【结果】母鸡采食量限饲显著提高子代28日龄腿肌脂肪含量(P＜0.05),56日龄时差异不显著(P＞0.05);子代肝脏脂肪含量品系间存在差异,高脂系显著高于低脂系(P＜0.05);品系与采食水平的互作对子代肝脏脂肪含量和28日龄胸肌脂肪含量影响显著(P＜0.05);子代腹脂率品系间差异极显著(P＜0.01)。56日龄时,子代肝脏FAS酶活性品系间差异显著(P＜0.05),品系与饲喂水平的互作对肝脏FAS酶活性影响显著(P＜0.05)。子代肝脏FAS mRNA表达丰度1日龄时品系间差异显著(P＜0.05);28日龄时,品系与饲喂水平的互作对肝脏FAS mRNA的表达影响显著(P＜0.05);母鸡采食量限饲显著提高了28日龄子代肝脏FAS mRNA的表达丰度(P＜0.05);56日龄时差异不显著(P＞0.05)。【结论】母鸡采食量限饲影响子代脂肪的沉积,且品系间表现出不同的趋势;56日龄时,肉仔鸡肝脏FAS酶活性品系间差异显著(P＜0.05),且品系与饲喂水平的交互作用影响显著(P＜0.05);肉仔鸡肝脏FAS mRNA的表达丰度受母体效应的影响,并且在其后生长过程中表现出补偿作用。