FSH和17β-雌二醇联合作用对仔猪睾丸 支持细胞Skp2表达的调节

 【目的】确定FSH和雌激素联合作用是否可通过ERK1/2级联调节培养条件下未成熟仔猪睾丸支持细胞中Skp2的表达。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用Western blotting和实时荧光定量PCR检测Skp2蛋白、mRNA的表达。【结果】FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用时以时间依赖的方式促进了Skp2蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,这一作用在30 min时到达高峰;FSH（50 ng·mL-1）、17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）和forskolin单独作用均促进了Skp2蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对Skp2表达的影响与FSH或17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）单独作用无显著差异（P≥0.05）,而环磷酸腺苷抑制剂（Rp-cAMP）、蛋白激酶A（PKA）抑制剂（H-89）、L-Ca2+离子通道抑制剂（verapamil）和ERK1/2抑制剂（U0126）单独作用时对Skp2蛋白和mRNA的表达与空白对照相比无显著影响（P＞0.05）,但都抑制了FSH（50 ng·mL-1）与17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对Skp2蛋白和mRNA表达的影响（P＜0.05）。H-89、verapamil单独作用对ERK1/2（细胞外信号调节的蛋白激酶1/2）活性没有影响,但降低了FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对ERK1/2活性的影响。【结论】 FSH与17β-雌二醇联合作用激活了cAMP-PKA级联和Ca2+内流,而PKA和Ca2+内流又通过影响ERK1/2的活性进而影响Skp2的表达。     

17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2(SBD-2)表达的可能信号通路研究

【目的】探讨17β-雌二醇(E2)上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2表达的可能信号通路。【方法】分离培养绵羊输卵管上皮细胞,将第2代输卵管上皮细胞分为E2(10-8 mol/L)组、雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-7mol/L)组、PKA阻断剂KT-5720(1μmol/L)组、PKC阻断剂H-7(50μmol/L)组、NF-κB阻断剂PDTC(50μmol/L)组及空白对照(Control)组,在不同阻断剂组加入各自阻断剂干预绵羊输卵管上皮细胞1h后,在各阻断剂组和E2组中再加入10-8 mol/L 17β-雌二醇培养6h,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组SBD-2mRNA表达水平的变化。【结果】10-8 mol/L 17β-雌二醇可显著上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2mRNA的表达(P<0.05);雌激素受体拮抗剂ICI182780、NF-κΒ阻断剂PDTC、PKC阻断剂H-7均可阻断17β-雌二醇对SBD-2的上调作用,PKA阻断剂KT-5720对17β-雌二醇介导的SBD-2上调无明显影响。【结论】17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2的表达由雌激素核受体、NF-κΒ、PKC信号转导通路所介导,而PKA不参与17β-雌二醇对SBD-2的上调作用。     

FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和 cyclin E1 mRNA表达的影响

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR 检测cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH（0—100 ng•mL-1）均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在FSH浓度为50 ng•mL-1时两种基因的表达量最大（P＜0.05）;FSH（50 ng•mL-1）也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在作用30 min时其表达量达到高峰（P＜0.05）。不同浓度的Foskolin （0—20 μmol•L-1）均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP（0—40 μmol•L-1）、H-89（0—30 μmol•L-1）和Verapamil（0—100 μg•mL-1）以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果（P＜0.05）,但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126（0—10 μmol•L-1）降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显著差异（P＞0.05）。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。     

不同剂量胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn mRNA表达的影响

 【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn（neonatal Fc receptor,FcRn）mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素（0.01、0.1和1 μmol•L-1）、胰岛素（0.005、0.1和0.5 μmol•L-1）、甲状腺素T4（0.01、0.1和1 μmol•L-1）,体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高（P＜0.05）,胰岛素在添加量为0.005 μmol•L-1和0.5 μmol•L-1时FcRn mRNA的表达量低,但在0.1 μmol•L-1添加时表达量显著升高（P＜0.05）。【结论】添加外源胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素能够影响FcRn mRNA的表达,为进一步研究乳腺内FcRn受体变化以及影响因素提供了依据。     

雌二醇和孕酮对小鼠子宫半胱亚磺酸脱羧酶基因表达和牛磺酸含量的调控

实验主要研究了17β-雌二醇(E2)和孕酮(P4)对小鼠子宫组织中半胱亚磺酸脱羧酶基因(CSD)表达和牛磺酸含量的调控。给去卵巢小鼠分别皮下注射植物油(对照组)、17β-雌二醇(E2)、孕酮(P4)、E2和P4、E2和氟维司群(ICI 182780)、P4和米非司酮(RU486),24h后观察各组小鼠子宫中CSD的表达和牛磺酸的含量。Real-time PCR和Western blot定量分析结果显示,每只小鼠注射1μg E2能够显著抑制CSD的mRNA和蛋白的表达,6mg P4能够显著促进CSD mRNA和蛋白的表达,其受体抑制剂RU486和ICI182780都能逆转它们的作用。高效液相色谱(HPLC)测定结果显示,注射1μg E2和6mg P4分别下调和上调子宫组织中牛磺酸的含量。上述结果提示E2和P4可能通过受体途径参与调节子宫CSD的表达,从而调节子宫中牛磺酸含量。     

17β-Estradiol Regulates Cultured Immature Boar Sertoli Cell Proliferation via the cAMP-ERK1/2 Pathway and the Estrogen Receptor β

Estrogen plays an important role in regulating Sertoli cell number in the testis. The objective of the study was to identify whether 17β-estradiol affected the proliferation of cultured, immature boar Sertoli cells via the estrogen receptor β （ERβ） and the cAMP-extracellular signal-regulated kinase （ERK1/2） pathway. Low levels （10-10-10-8 mol L-1） of 17β-estradiol increased cell number, but high levels （10-7-10-6 mol L-1） decreased it （P〈0.05）. Sertoli cell number began to recover for an additional 24 h in the medium without 17β-estradiol （10-6 mol L-l） （P〉0.05）. The effects of 17β-estradiol （10-9 mol L-1） peaked at the first 24 h （P〈0.05）. 17β-estradiol activated ERK1/2 from 5 min to 24 h, but the activiy of ERK1/2 began to decrease after 4 h. Both PD98059 and U0126, two ERK inhibitors, blocked cell division （P〈0.05）. 17β-estradiol （10-10-10-6 mol L-1） dose-dependently increased cAMP production （P 〈 0.05）, and both 17β-estradiol （10-9 mol L-1） and forskolin, which increases cAMP levels, induced cell proliferation and activated ERK1/2 （P〈 0.05）. Rp-cAMP, an antagonist of cAMP, blocked this 17β-estradiol activity （P〈 0.05）. Two estrogen receptor antagonists, ICI 182780 and ERβ antagonist （ERβAnt）, reduced Sertoli cell number, cAMP production and ERK1/2 activation （P〈 0.05）, but ERaAnt did not （P〉 0.05）. Therefore, 17β- estradiol mainly promotes pig Sertoli cell proliferation via ERβ to induce cAMP production and ERK activation to promote cell proliferation.     

Kisspeptin-10对无血清培养鸡F1级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响及机制研究

【目的】研究kisspeptin-10对无血清培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的作用及可能机制。【方法】选取200日龄处于产蛋高峰期的伊莎蛋鸡,于排卵前剖腹收集F1卵泡,分离纯化颗粒细胞,于含胎牛血清培养基中培养24 h,换成无血清培养基稳定培养24 h后,用不同浓度的Kp-10、U73122、EGTA等单独或共同处理细胞,收集细胞上清,放射免疫学方法检测培养基中孕酮含量。【结果】（1）通过免疫细胞化学方法,显示颗粒细胞上有Kp-10免疫活性样物质的阳性表达;（2）Kp-10处理可显著增加无血清培养的颗粒细胞的活力,100 nmol•L-1时可显著促进孕酮的分泌（P＜0.05）;（3）与对照组相比,2 μmol•L-1 U73122（磷脂酶C抑制剂）对孕酮的分泌无显著影响（P＞0.05）,而0.5、2 μmol•L-1 U73122能显著降低Kp-10对孕酮分泌的促进作用（P＜0.05）;（4）钙离子阻断剂Verapamil（1-100 μmol•L-1 ）呈剂量依赖性降低孕酮的分泌,于100 μmol•L-1时达显著降低水平（P＜0.05）;与1 μmol•L-1 Verapamil单独处理组相比,100 nmol•L-1 Kp-10与1 μmol•L-1 Verapamil同时处理可显著增加孕酮的分泌,而与10、100 μmol•L-1 Verapamil共同处理不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用（P＞0.05）,且胞内钙离子含量与上清液中孕酮分泌水平相一致;（5）与100 nmol•L-1 Kp-10处理组相比,1和5 mmol•L-1 EGTA共同处理时孕酮分泌显著降低,当再加入1.5 mmol•L-1 Ca2+时孕酮分泌量显著增加。【结论】Kp-10促进体外培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮的分泌,其机制可能与胞内Ca2+信号通路有关。     

围产期奶牛 Nod-2 受体表达变化及其对中性粒细胞呼吸爆发功能的影响

【目的】围产期奶牛对细菌性疾病的易感性升高。本研究的目的在于探讨 Nod-2 受体在围产期奶牛中性粒细胞（PMN）中的表达变化及其对 PMN 细胞呼吸爆发功能的影响,以揭示 Nod-2 在围产期奶牛免疫机能改变中的作用。【方法】 采用 RT-PCR 法检测围产期和非围产期泌乳奶牛外周 PMN 细胞中 Nod-2 mRNA 的表达变化;全血分别用佛波醇酯（PMA）和 Nod-2 受体特异性配体胞壁酰基二肽 MDP 刺激,采用流式细胞仪检测 PMN 呼吸爆发功能。【结果】围产期奶牛 PMN 细胞 Nod-2 mRNA 表达量显著低于非围产期奶牛（P＜0.05）;受 PMA 刺激后,围产期奶牛 PMN 呼吸爆发功能显著低于非围产期奶牛（P＜0.05）;受 MDP 刺激后,围产期奶牛 PMN 呼吸爆发功能亦较非围产期奶牛下降。【结论】围产期奶牛对细菌性疾病易感性升高可能与 Nod-2 mRNA 表达下调有关。     

氧化应激在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用

 【目的】探讨氧化应激在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用。【方法】采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉处理细胞,或者Z-VAD-fmk、NAC和镉共同处理细胞。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞内ROS水平和线粒体膜电位,分光光度法检测caspase-3活性、GSH和MDA含量。【结果】结果表明,肝细胞暴露于浓度为2.5、5、10 μmol•L-1的镉后,细胞相对存活率显著下降（P＜0.01）,凋亡率显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,呈剂量-效应关系;2.5和5 μmol•L-1镉组在1.5 h之前导致细胞内ROS水平显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;镉暴露可使肝细胞Δψm显著或极显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;NAC能够显著减少镉引起的凋亡细胞数量和极显著降低凋亡率（P＜0.01）,可以显著降低单独镉暴露组ROS水平升高和阻止ΔΨm降低（P＜0.05）;细胞内GSH含量12 h时随镉剂量增高而降低,部分剂量组极显著低于对照组（P＜0.01）,24 h时随剂量增高而升高,部分剂量组显著或极显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）;细胞内MDA含量随着镉浓度的增大而升高,10 μmol•L-1剂量组MDA的含量显著高于对照组（P＜0.05）;未见caspase-3活性升高,caspase抑制剂Z-VAD-fmk对镉致细胞凋亡无影响。【结论】醋酸镉致肝细胞凋亡与其引起ROS产生并导致氧化损伤的非caspase途径有关。     

17β-Estradiol Regulates SKP2 Expression in Cultured Immature Boar Sertoli Cells Mainly via Estrogen Receptor β, cAMP-PKA and ERK1/2

Estrogen plays an important role in regulating testicular Sertoli cell number. Furthermore, S-phase kinase-associated protein 2 （SKP2） plays a central role in mammalian cell cycle progression. The objective of this study was to determine whether 17β-estradiol can regulate the expression of SKP2, and the Sertoli cell cycle, via estrogen receptor β （ERβ）, the cyclic adenosine monophosphate （cAMP）-protein kinase A （PKA） and extracellular signal-regulated kinase （ERK1/2） pathway. When cultured immature boar Sertoli cells were treated with 17β-estradiol, a time-dependent increase in SKP2 mRNA and protein level was observed by real-time PCR and Western blot, and 17β-estradiol activity peaked at 30 min. Treatment with ICI182780 and ERβ antagonist reduced 17β-estradiol-induced expression of SKP2 and proliferating cell nuclear antigen （PCNA）, while increasing the protein concentration of p27kip1. However, the effect of ERa antagonist on these parameters was lower than that of ICI 182780 and ERβ. Forskolin had a similar effect as 17β-estradiol on the expression of SKP2, PCNA and p27kip1, Rp-cAMP, H-89 and U0126 treatment reduced 17β-estradiol-induced changes, while H-89 also inhibited ERK1/2 activation. Therefore, 17β-estradiol mainly regulates SKP2 mRNA and protein expression via ERβ-cAMP-PKA and ERK1/2 activation. SKP2 and PCNA expression were positively correlated, while increased SKP2 expression likely resulted in p27kip1 degradation.     

温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠EAATs mRNA表达差异及发育性变化

 【目的】研究温氏土鸡（WYFC）和隐性白洛克（WRRC）鸡胚小肠酸性氨基酸转运载体EAAT2（SLC1A2）和EAAT3（SLC1A1）mRNA的表达差异和发育性变化。【方法】选取蛋重相近的两品种纯系种蛋各96枚,每个品种随机分为6组,每组16枚,在相同的条件下进行孵化。分别就每个品种在9（E9）、12（E12）、14（E14）、17（E17）和19胚龄（E19）及出壳当天（DOH）选取16枚鸡胚,称重后采集小肠样品,采用real-time RT-PCR方法检测小肠EAATs mRNA的相对表达丰度。【结果】（1）9、12、14、17和19胚龄隐性白洛克胚蛋重量及出壳当天雏鸡体重极显著高于温氏土鸡（P＜0.01）;（2）从发育性变化来看,EAAT2 mRNA在两个品种表达基本一致,即E9—14表达量下调,E17有所上调,随后下调,E12、E17、E19和DOH两品种差异极显著（P＜0.01）,E14差异显著（P＜0.05）;EAAT3 mRNA在两个品种都表现为随胚龄增加而表达上调,E19两品种差异极显著（P＜0.01）,E12差异显著（P＜0.05）;（3）EAAT2和EAAT3 mRNA表达丰度,温氏土鸡鸡胚小肠高于隐性白洛克,不同发育阶段对其都有影响,均存在“品种×胚龄”的互作效应。【结论】EAATs mRNA表达丰度在品种和胚龄间存在差异,不同基因表达的发育模式亦不相同。     

湖羊BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因mRNA表达水平与排卵数关系的研究

 【目的】研究湖羊卵巢组织BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因mRNA表达水平与排卵数的相关性,筛选影响湖羊多胎性状的候选基因,为揭示湖羊高繁多胎分子遗传机理提供参考。【方法】选取16只经产湖羊母羊,分为产单羔组和多羔组,发情后24～36 h屠宰,取卵巢,计数排卵点,记录排卵数;应用RT-PCR技术检测BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因的组织表达特征,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析各基因mRNA在单羔组和多羔组卵巢组织中的表达差异。【结果】BMP2、BMP4和BMP7基因在湖羊母羊卵巢组织内表达,而且在垂体及下丘脑、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、输卵管组织中均有表达;BMP6基因仅在湖羊母羊卵巢、肾脏、肌肉和输卵管组织中表达。在卵巢组织,多羔组排卵数极显著高于单羔组（P＜0.01）,且多羔组BMP4基因mRNA表达极显著高于单羔组（P＜0.01）,而BMP2、BMP6和BMP7基因mRNA表达在单羔组和多羔组间无显著差异（P＞0.05）;相关分析表明在卵巢组织中,只有BMP4基因mRNA表达与排卵数呈正相关(r = 0.741,P ＜0.05)。【结论】BMP4基因mRNA表达在单羔组和多羔组间差异显著,可能对湖羊排卵数起关键作用,是影响湖羊排卵数的候选基因。     

湖羊排卵相关基因表达水平与繁殖性能关系的研究

 【目的】研究湖羊卵巢组织COX2、HAS2、TSG6和PTX3的mRNA表达水平与湖羊繁殖性能的相关性,筛选影响湖羊高产的候选基因,为揭示湖羊高繁多胎分子遗传机理提供依据。【方法】选取16只经产湖羊母羊,分为低产组和高产组,于发情后24—36 h屠宰,应用RT-PCR技术检测COX2、HAS2、TSG6和PTX3的组织表达特征,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析各基因mRNA在低产组和高产组湖羊卵巢组织中的表达差异。【结果】COX2、HAS2、TSG6和PTX3均在湖羊卵巢组织中表达,在卵巢组织,高产组TSG6和PTX3的mRNA表达极显著高于低产组(P＜0.01),低产组HAS2的mRNA表达极显著高于高产组(P＜0.01),而COX2的mRNA表达在高产组和低产组间无显著差异(P＞0.05)。【结论】HAS2、TSG6和PTX3的mRNA表达在高产组和低产组间差异极显著,可能与湖羊繁殖性能相关,可作为影响湖羊高产的候选基因。     

PCV2感染仔猪急性期蛋白的变化

【目的】探讨实验性感染PCV2仔猪血清中急性期蛋白浓度和肝脏急性期蛋白表达的变化,为PCV2的致病机制和诊断提供有价值的资料。【方法】19头ELISA检测PCV2抗体阴性的5周龄健康断奶仔猪,随机分为对照组和攻毒组,在攻毒后不同时间采集血液和肝脏。用ELISA方法检测血清中APPs的动态变化,荧光定量RT-PCR测定肝脏中APPsmRNA表达,同时观察肝脏的组织病理学变化。【结果】仔猪接种PCV2后,肝脏出现实质细胞变性,结缔组织增生和嗜酸性粒细胞浸润为特征的病理学损伤;血清中,猪主要急性期蛋白(Pig-MAP)在攻毒后7d达到峰值,在7和10d显著高于对照组(P0.05);血清淀粉样蛋白A(SAA)在攻毒后7d和21d显著高于对照组(P0.05);血清载脂蛋白AⅠ(Apo-AⅠ)攻毒后21d显著高于对照组(P0.05),其余时间差异均不显著;PCV2感染后21d仔猪肝脏中结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、α1-酸性糖蛋白(AGP)和SAAmRNA的表达呈现升高的趋势。【结论】PCV2感染可引起仔猪肝脏出现以实质细胞变性坏死和结缔组织增生为特征的病理学变化,血清APPs浓度和肝脏APPsmRNA表达呈现不同的变化,其中Pig-MAP可以作为病程发展的重要检测指标,对监测PCV2感染、疾病的预后起重要作用。