超强毒RB1B株马立克氏病UL49基因的克隆和序列分析

鸡马立克氏病病毒UL49基因编码的被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用。根据已发表的MDV-1 Md5株的序列，从马立克氏病超强毒RB1B株感染的鸡胚成纤维细胞中提取病毒基因组DNA，经PCR扩增UL49基因并克隆入pMD18-T Simple载体。RB1B株UL49基因经核酸序列测定分析，全长为750碱基。将RB1B株与Md5株和GA株的UL49进行比较，发现马立克氏病病毒强毒株间的UL49基因高度同源，为利用RB1B的UL49基因作为基因治疗的靶序列奠定了理论基础。     

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒（PRV）Ea株UL49.5基因片段为探针，同SalI、KpnI、BamHI消化的PRV Ea株基因组DNA进行Southern杂交，确定SalI2.8kb、KpnI17.0kb、BamHI25.0kb片段中含UL49基因。将SalI2.8kb片段克隆到pUC119中，利用其中的BamHI进行亚克隆，获得重组质粒pUC2.0。测定约2.0kb片段的全序列并进行序列分析，发现该片段包含UL50基因部分编码区，UL49.5基因和UL49基因的完整编码区，并且在UL49基因下游，还存在一段约369个碱基的序列，经与人单纯疱疹病毒I型（HSV－1）、牛单纯疱疹病毒I型（BHV－1）的UL48基因进行比对，具有较高的同源性，推测为PRV UL48基因的部分编码区。     

马立克氏病病毒超强毒UL49基因siRNA表达质粒的构建与鉴定

以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1-u6 neo vector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列.以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功.     

马立克氏病病毒超强毒UL49基因siRNA表达质粒的构建与鉴定

以马立克氏病病毒超强毒（RB1B株）UL49为靶基因，利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA，再定向克隆至pSilencer^TM2.1-U6 neo vector载体中构建siRNA表达重组体，转化DH5仪菌株，提取质粒酶切鉴定后，进行测序分析，证实为所需序列。以上结果表明，针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。     

鸭肠炎病毒强毒和疫苗弱毒鉴别诊断PCR方法的建立

为建立鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)强毒和疫苗弱毒的鉴别诊断方法,通过分析比较GenBank数据库中上传的DEV强毒株和疫苗弱毒株UL2基因核苷酸序列,分析DEV疫苗弱毒和DEV强毒在UL2基因上的核苷酸序列,利用引物设计软件Oligo 7.0,设计一组可对DEV强毒株和疫苗弱毒株UL2基因进行编码区全长扩增的特异性引物,经条件优化后建立DEV强毒和疫苗弱毒鉴别诊断的PCR方法。结果表明,DEV疫苗弱毒和DEV强毒在UL2基因上存在528bp的连续核苷酸序列缺失。优化后的PCR方法最佳退火温度为55℃,对DEV强毒和疫苗弱毒扩增片段大小分别为1 019bp和491bp;敏感性强,最低检测限为15.3pg;特异性好,对鸭源常见传染病(如番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)均无特异性扩增。     

鸭瘟病毒强弱毒株TK基因的克隆及序列比较分析

根据GenBank中已发表的鸭瘟病毒TK基因序列,设计一对引物,对1株鸭瘟病毒强毒和1株鸭瘟病毒疫苗毒进行PCR扩增。将扩增的目的片段分别克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒,然后对阳性重组质粒进行序列测定及分析。结果表明,本实验所扩增的鸭瘟病毒TK基因及侧翼UL24基因大小为1 995 bp,鸭瘟强、弱毒株TK基因及侧翼UL24基因序列完全相同,该病毒TK基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911509与AY963569,四川株DQ640611,AV1221株EF173464,sd-01株EF417996同源性分别为99.5%,99.9%,100%,99.9%,100%,而该病毒UL24基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911511,DQ227739,EF417996同源性为99.9%,99.8%,99.9%,表明鸭瘟病毒强弱毒株TK基因及侧翼UL24基因高度保守。为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体奠定了基础。     

一株鸭瘟病毒的分离与鉴定

从湖北省武汉市某种鸭场送检的死亡鸭肝脏中分离到1株病毒,结合流行病学调查,剖检病理变化特征初步诊断为鸭瘟病毒感染。根据Gen Bank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对引物,提取病毒核酸DNA进行PCR扩增,得到大小约为416 bp的目的片段。测序结果表明与Gen Bank上公布的鸭瘟病毒UL6基因的序列相似性达到99%。鸭胚感染试验表明,感染的鸭胚在第四天开始死亡,并出现典型的鸭瘟病毒感染症状。上述结果表明,该种鸭场种鸭死亡是由鸭瘟病毒所引起的。     

人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段.序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%.将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 h的外源蛋白.表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用.     

人巨细胞病毒ppl50抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗，根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物，利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段。序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100％。将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35ku的外源蛋白。表达产物免疫小鼠，所得抗体具有低滴度中和作用。     

MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析

血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的UL49h基因编码病毒被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用.根据已发表的MDV-1 GA株的序列,从CVI988/Rispens弱毒株感染的鸭胚成纤维细胞中扩增VP22基因片段,结果获得大小为732 bp的PCR产物.将PCR产物克隆T载体并测序分析,结果发现,与经典强毒GA株相比,弱毒株CVI988的VP22存在3个定点突变和一个缺失性突变.缺失的位点亲水性强,并位于VP22主要的抗原决定簇区.结果证明强毒株与弱毒株的VP22存在明显差异,为利用CVI988 VP22的蛋白传导域传导目的蛋白奠定了理论基础.     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

中性β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建

利用RT-PCR方法从芽孢杆菌Bacillus Subtilis CY110中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为1 398 bp,该序列与Gen-Bank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQN01000006.1序列相比同源性达到99.8%,氨基酸序列同源性达到99.5%。将产物与pET-28 a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。     

鸽热休克蛋白70基因的扩增与同源性比较

[目的]扩增鸽热休克蛋白(HSP)70基因,并与其他禽类作同源性比较。[方法]参考禽类的HSP70基因序列设计、合成引物,从热应激鸽肝脏组织中提取总RNA作为模板,RT-PCR扩增目的基因。[结果]RT-PCR扩增到的基因片段为576 bp,经测序,确定为鸽HSP70基因;鸽HSP70基因与鸡、鹌鹑、珍珠鸡同类基因序列的同源性达97%以上。[结论]禽类的HSP70基因具有较高保守性。     

I型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的DHV I的基因序列,设计了1对针对DHV I保守区的特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭病毒性肝炎病毒快速鉴别诊断的RT-PCR方法,扩增片段大小为632 bp。试验表明,RT-PCR法具有很强的特异性,且该方法的敏感性明显高于常规的检测方法。对鸭病毒性肝炎的病料检测证明,该方法能有效鉴别DHV,特异性良好。     

花生共生受体类蛋白激酶基因的克隆及生物信息学分析

共生受体类蛋白激酶（symbiosis receptor-like protein kinase, SYMRK）是控制植物与微生物共生的关键调控基因,利用基因组步移技术,克隆得到花生symrk的全长基因及其560 bp的ATG上游序列。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的常规理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和高级结构等进行了预测和分析,结果表明Ah-symrk由15个外显子和14个内含子组成,cDNA全长3 042 bp,包含2 781 bp的ORF,编码926个氨基酸,为疏水性酸性蛋白质,定位于细胞膜;ATG上游序列包含3个与根特异表达有关的顺式作用元件root motif tapox1;RT-PCR验证,该基因在花生根中特异性表达。     

小鼠肝炎病毒RT-PCR检测方法的研究

用4株小鼠肝炎病毒(MHV1,MHV3,A59,JHM)分别感染DBT细胞,收获病毒,提取病毒RNA。根据病毒基因的特异性保守序列设计引物,在最佳务件下进行RT—PCR,建立了RT—PCR检测方法,即两步法和一步法,分别扩增出600bp,375bp的特异性核酸片段,其中,一步法检测MHV更快速、简便。     

意大利蜜蜂碳酸酐酶相关蛋白X的基因克隆及序列分析

[目的]对意大利蜜蜂(Apis mellifera)碳酸酐酶相关蛋白(CARPs)X的基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]通过RT-PCR扩增得到CARP X基因的cDNA序列,同时对序列进行生物信息学分析。[结果]意大利蜜蜂CARP X基因的cDNA全长972 bp,编码324个氨基酸残基,推导的氨基酸序列具有1个信号肽、2个跨膜区;预测其分子量和等电点分别为37.1 kD和7.458;该蛋白质与小蜜蜂(Apis florea)、熊蜂(Bombus impatiens)、Bombus terrestris、金小蜂(Nasonia vitripennis)、豌豆蚜虫(Acyrthosiphon pisum)的CARP X有很近的亲缘关系;聚类分析显示在昆虫体内可能具有2种不同类型的CARP X。[结论]该研究为CARPs蛋白家族的研究提供了可靠的理论基础。     

薯蓣皂苷糖苷酶基因的克隆及同源性分析

[目的]从分子生物学水平上研究Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶,对该酶基因CDS区的序列进行调取和分析。[方法]根据薯蓣皂苷糖苷酶的N端序列设计简并引物,以总RNA为模板进行RT-PCR调取cDNA,然后采用3＇RACE和5＇RACE技术,调取CDS区基因全序列。[结果]测序得到序列长度为1 497 bp。该基因的同源性比较分析表明,薯蓣皂苷糖苷酶基因与α-鼠李糖苷酶没有同源性,与α-淀粉酶的基因序列具有很高的同源性,达到93%以上。[结论]蛋白质结构存在差异,酶反应特性不同。