2株不同来源的新城疫病毒的F基因克隆和序列分析

以1株从发病鸽中分离到的新城疫病毒(PNDV／99株)和1株从发病鹅中分离到的新城疫病毒(GNDV／00株)为研究对象，用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)对它们的F基因进行分段扩增、定向克隆到pUCll9质粒载体，然后测定它们的核苷酸序列，并推导出相应的氨基到序列。PNDV／99株和GNDV／00株的F基因全长1662bp，编码553个氨基酸，它们的裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，是NDV弱毒株特有的序列结构。序列分析结果表明，它们2株之间的核苷酸同源率高达99．28％，氨基酸同源率则为100％；它们与国内标准毒株F48E9的核苷酸同源率只有87．48％和87．36％，氨基酸的同源率都为91．68％；而它们与弱毒株La Sota的核苷酸同源率别为98．50％和98．74％，氨基酸同源率都为98．73％。     

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒（PRV）Ea株UL49.5基因片段为探针，同SalI、KpnI、BamHI消化的PRV Ea株基因组DNA进行Southern杂交，确定SalI2.8kb、KpnI17.0kb、BamHI25.0kb片段中含UL49基因。将SalI2.8kb片段克隆到pUC119中，利用其中的BamHI进行亚克隆，获得重组质粒pUC2.0。测定约2.0kb片段的全序列并进行序列分析，发现该片段包含UL50基因部分编码区，UL49.5基因和UL49基因的完整编码区，并且在UL49基因下游，还存在一段约369个碱基的序列，经与人单纯疱疹病毒I型（HSV－1）、牛单纯疱疹病毒I型（BHV－1）的UL48基因进行比对，具有较高的同源性，推测为PRV UL48基因的部分编码区。     

伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒TK基因的序列设计了1对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体．对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性．测序结果表明目的片段包含1个957bp的开放性阅读框(ORF),编码318个氨基酸组成的多肽．在TK ORF上游-22,-166,-199位存在3个GC框样序列,在终止密码子下游第110个核苷酸处的l306位存在有多聚腺苷加尾信号．PRV Min-A株与PRV Ea株、NIA-3株TK的核苷酸同源性分别为98．4％,97．9％;推导氨基酸的同源性分别为97．8％,97.2％．通过对α疱疹病毒TK氨基酸进行多序列比较．获得了在PRV TK氨基酸序列上的6个保守区间．推测这些保守氨基酸对于胸苷激酶(TK)结构的稳定性和催化活性的发挥是必需的。     

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定,结果表明:gB、gC、gD基因序列全长分别为2 745 bp、1464 bp、1 215 bp,编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示:Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9%~99.9%,氨基酸序列的同源性为91.4%~99.9%。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明,中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支,而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里,闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近,3个基因的同源率均在99.5%以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株(Ea株、Fa株)比欧美分离株多了1个氨基酸,氨基酸残基的突变主要集中在第50~100氨基酸。在gC基因序列第186~211 bp,Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上,Ea株、Fa株比其他分离株多了2~6个氨基酸。在gD基因序列第803~837 bp,Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多,达到7个。     

1株猪副粘病毒的分子鉴定

以1株从发病猪中分离到的副粘病毒(MF01株)为研究对象，用反转录-聚合酶链式反应(RT—PCR)对它的F基因进行分段扩增、定向克隆到pUC119质粒载体，然后测定它们的核苷酸序列，并推导出相应的氨基酸序列。MP01株的F基因全长1662bp，编码553个氨基酸，它们的裂解位点的氨基酸序列为^112G—K-Q-G-R—L^117，是NDV弱毒株特有的序列结构。序列分析结果表明，它与国内标准毒株F48E9的核苷酸同源率为90％，氨基酸的同源率为93％；它与弱毒株LaSota的核苷酸同源率为91％，氨基酸同源率为94％。     

超强毒RB1B株马立克氏病UL49基因的克隆和序列分析

鸡马立克氏病病毒UL49基因编码的被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用。根据已发表的MDV-1 Md5株的序列，从马立克氏病超强毒RB1B株感染的鸡胚成纤维细胞中提取病毒基因组DNA，经PCR扩增UL49基因并克隆入pMD18-T Simple载体。RB1B株UL49基因经核酸序列测定分析，全长为750碱基。将RB1B株与Md5株和GA株的UL49进行比较，发现马立克氏病病毒强毒株间的UL49基因高度同源，为利用RB1B的UL49基因作为基因治疗的靶序列奠定了理论基础。     

猪伪狂犬病病毒的分离与鉴定

用猪睾丸细胞(ST细胞)从1只发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,第6代时的毒价为107.75 TCID50/mL.用猪伪狂犬病病毒特异性引物可从该病毒细胞培养物中扩增出与预期大小相同的gB基因部分核苷酸片段.测序结果表明:该gB基因的部分序列与GeneBank登录的5株PRV同源性为98.0％～99.5％.接种家兔后可观察到典型的伪狂犬病临床症状,ELD50为10-7.50/mL,分离毒可被PRV阳性血清中和.该分离毒为猪伪狂犬病病毒强毒株.     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT—PCR法，以1株H5N1。亚型禽流感病毒RNA为模板，扩增了NP全基因cDNA。将NP cDNA克隆于pMD18-T载体，并对其进行测序。测序结果表明：所克隆的NP基因全长1542bp，该核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架，其中编码区为1497个核苷酸，编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较，各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92．5％～95．9％，编码的氨基酸同源性为97．0％～98．4％。通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

禽流感病毒H9N2亚型HA基因的序列分析

试验对1株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增、克隆,然后对毒株的HA基因进行阳性克隆鉴定。测序结果表明:所扩增的HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;该毒株的裂解位点的氨基酸序列为R-S-S-R,属于低致病力毒株,该毒株有7个潜在糖基化位点,受体结合位点的氨基酸分别为YWT-NVLY,左侧壁氨基酸为NGQQG,右侧壁为GTSKA。将该毒株与国内一些参考毒株的HA基因序列进行比较分析,结果表明,核苷酸与氨基酸同源率较高,核苷酸同源率为93.0%~97.3%,氨基酸同源率为95.4%~96.6%,亲源关系比较近;与韩国毒株核苷酸和氨基酸同源率分别为83.3%和87.3%,亲源关系比较远。     

葡萄扇叶病毒外蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT－PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物（GFLV－H）基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段，并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector。序列分析结果表明，该基因含有1515个核苷酸，编码504个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88％和95％。目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121，经三亲交配导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中。     

伪狂犬病病毒鄂A株gC基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

 以伪狂犬病病毒国内地方分离株 (鄂A株 )为材料 ,采用核酸杂交、DNA重组技术直接从基因组DNA中克隆了最主要的保护性抗原基因gC ,测定了全序列并对其原核表达产物作为血清学诊断抗原进行了初步探讨。结果表明 :所克隆的 gC基因全长 175 5bp(含启动子序列和 poly(A)信号序列 ) ,具有典型I型膜蛋白结构特征。同具有代表性的国外标准株NIA 3株、IndianaS株相比 ,多个酶切点不同 ,尤其是具有分型意义的BamHI位点消失 ;氨基酸水平上也存在一定程度的差异 ,鄂A株 gC可编码 4 87个氨基酸残基 ,而以往所报道的gC均只编码 4 78或 4 79个氨基酸 ,有意义的是功能区突变较多 ,并存在连续 7个氨基酸残基的插入。同 pET 2 8a的 6xHis Tag融合的gC基因完整编码区在大肠杆菌中获得高效表达 ,融合蛋白分子量为 6 2ku ,能同伪狂犬病病毒高免血清发生特异性反应。纯化的表达产物作为ELISA和乳胶凝集诊断抗原 ,具有很高的敏感性和特异性     

Cloning and Sequence of Glycoprotein H Gene of Duck Plague Virus

The glycoprotein H （gH） gene homologue of duck plague virus （DPV） was cloned by degenerate polymerase chain reaction （PCR） and sequenced. It was located immediately downstream from the thymidine kinase gene （TK）. In addition, the 3＇-end of the gene homologue to herpesvirus UL21 was located downstream from the gH gene. DPV gH gene open reading frame （ORF） was 2 505 bp in length and its primary translation product was a polypeptide of 834 amino acids long. It possessed several characteristics of membrane glycoproteins, including an N-terminal hydrophobic signal sequence, an external domain containing eight putative N-linked glycosylation sites, a C-terminal transmembrane domain, and a charged cytoplasmic tail. Comparison with other herpesvirus revealed identities of 20.2, 25.1, 23.0, 23.0, 26.5 and 26.0% with the gH counterparts of the human herpesvirus virus 1 （HSV1）, equine herpesvirus 4 （EHV4）, bovine herpesvirus 1 （BHV1）, pseudorabies virus （PRV）, gallid herpesvirus 2 （GHV2） and gallid herpesvirus 3 （GHV3）, respectively.     

猪伪狂犬病毒YZ株gE全基因的克隆与序列分析

为了解猪伪狂犬病毒(PRV)g E基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV g E全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了g E全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株g E基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株g E全基因序列由1 862bp组成,与Gen Bank已发表的13株PRV g E参考株序列同源性介于97.9%~99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

不同花生品种B06基因的克隆与序列分析

Dof（DNA binding with one finger）转录因子是一类植物特有的、进化上高度保守的基因家族,对植物多方面的生理过程均发挥调控作用。根据Dof家族中的一个B06基因的cDNA保守序列设计引物,对8个品种花生的B06基因进行PCR扩增克隆相似基因,并测定序列。实验成功克隆出四粒红和073103的完整...