表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

敲除Ac148-150对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒复制和外源蛋白表达的影响

【目的】同时敲除苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组的Ac148、Ac149、Ac150(Ac148-150)基因,检测敲除Ac148-150基因片段对AcMNPV复制和外源蛋白表达能力的影响,为基因功能鉴定和缩小杆状病毒基因组提供参考。【方法】利用Red/ET同源重组系统和rpsL-AMP反向筛选系统对Ac148-150基因进行敲除,得到敲除型杆状病毒质粒(KOAc148-150杆状病毒质粒),提取AcMNPV KOAc148-150杆状病毒质粒和野生型杆状病毒质粒,将其分别与报告基因表达载体共转染Sf9细胞,成功构建重组杆状病毒(野生型病毒vAcMNPV/GFP和缺失突变病毒vAc△148-150/GFP),测定2种重组杆状病毒的一步生长曲线并比较其差异。将2种重组杆状病毒感染Sf9细胞后,采用荧光显微镜观察GFP荧光细胞分布,用流式细胞仪检测GFP荧光强度,再通过SDS-PAGE和Western blot检测Ac148-150缺失突变体表达的GFP产量。【结果】菌落PCR结果表明,AcMNPV中Ac148-150基因敲除成功。缺失突变病毒vAc△148-150/GFP与野生型病毒vAcMNPV/GFP的一步生长曲线基本一致,说明Ac148-150缺失不影响病毒的复制。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果表明,敲除Ac148-150对外源蛋白GFP分布和荧光强度未产生影响。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,缺失突变病毒vAc△148-150/GFP和野生型病毒vAcMNPV/GFP表达GFP蛋白产量基本一致。【结论】从AcMNPV基因组中同时敲除Ac148、Ac149、Ac150基因后,对病毒的复制和外源蛋白的表达能力无影响。     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记效果

以水母绿色荧光蛋白基因为模板进行PCR扩增得到目的基因(Green fluorescence protein, GFP),然后加上酶切位点BamHI和NheI,构建pLenti6.3IRESEGFP载体,转染DH5α感受态细胞进行菌落PCR,取阳性进行酶切鉴定,再取呈阳性的质粒进行测序,使用浓度为1 μg/μL的质粒与慢病毒表达载体进行连接,通过荧光显微镜观察到绿色荧光,表明本实验获得的GFP和慢病毒载体整合成功;用此转染293T细胞,通过荧光显微镜同样检测到了绿色荧光。使用建鲤的组织提取RNA,然后按照Fermentas公司的MMLV操作说明书进行反转录,得到IGF2b基因后加酶切位点进行扩增,将IGF2b整合到用GFP作为标记基因的慢病毒载体上,再以此转染建鲤未分裂的受精卵,48 h后通过荧光显微镜也观察到了绿色荧光蛋白的表达。试验表明绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记是成功的。这些结果为基于含有GFP慢病毒转基因鱼育种技术的开发奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成

【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认。使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体。通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB。观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量。【结果】与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5μg DNA/孔转染效率最高。相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P0.01)。与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P0.01)。Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显。Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但变化不明显。【结论】GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

The Effects of Downstream 3513bp of UL56 on Characterization of Duck Enteritis Virus

【Objective】Duck enteritis virus (DEV) taxonomically belongs to family Herpesviridae and infects ducks, geese, and swans, which results in high mortality and decreased egg production in domestic and wild waterfowl. Several DEV whole genomic sequences were published, which contained 158-162 kb. Compared with DEV vaccine strain, the virulent DEV strain for vaccine evaluation had a 3513-bp insertion, resulting to UL56 frameshift mutation. At present, there are few papers about DEV gene function and pathogenic mechanism. To study the effect of the 3513-bp insertion on DEV characterization, a recombinant DEV with the 3513-bp deletion was constructed.【Method】The extracted DEV genomic DNA was used as template to amplify the UL56-u and UL56-d of the upstream and downstream ends of UL56 gene, respectively. The two homologous arm fragments were cloned into pMD18T-Simple vector, and the recombinant plasmid pT-UL56ud was obtained. The recombinant plasmid pT-UL56ud was cut by MluI enzyme, and after electrophoretic recovery and dephosphorylation, the recombinant plasmid pT-UL56-RFP was obtained by inserting RFP expression box into pT-UL56ud. After DEV was inoculated with duck embryo fibroblast (DEF) (MOI=0.1) for 1 to 2 h, the purified plasmid pT-UL56-RFP was transfected according to Lipofectamine 2000 instructions, and then purified by plaque. A 3513-bp deletion mutant, DEVΔ3513-RFP, was generated by targeted homologous recombination, in which red fluorescent protein (RFP) as a reporter replaced the 3 513 bp. The RFP was then removed to generate DEV△3513. A rescue mutant, DEVΔ3513(R), was constructed by reinserting the 3 513 bp into the genome of DEVΔ3513-RFP. The recombinant virus and its parent virus were inoculated in DEF (MOI =0.01), the virus titer was measured and the growth curve was plotted. The recombinant virus and its parent virus were diluted properly and inoculated into monolayers DEF, covered with M199 agarose and cultured 5-7 days. Twenty plaques were selected randomly and the area of plaques was assayed. Six-week old susceptible ducks were inoculated with 10 ^5.0TCID₅₀ of the 3513-bp deletion mutant, rescue mutant and its parental virus, respectively. After 10 days, all the surviving ducks were euthanized. The liver tissues were taken from all the animals and fixed to 4% poly Formaldehyde Solution; the pathological sections were prepared by routine procedures and stained with HE. The recombinant virus and the Duck Plague Live Vaccine (CVCC AV1222) were injected with 10 ^3.0TCID₅₀ in muscles for 6 weeks of age susceptible ducks to be tested for immunogenicity. After 14 days, all vaccinated ducks were challenged with 10 ^3.0MLD of lethal DEV (CVCC AV1221).【Result】The recombinant viruses, DEVΔ3513 and DEVΔ3513(R), and their parental virus possessed similar growth kinetics, and their titer peaked at 72 hours with the peak titer 10 ^6.2-6.5TCID₅₀/0.1mL. Their average plaques sizes were not significantly different; DEVΔ3513 was avirulent in 6-week ducks; the ducks vaccinated with 10 ³TCID₅₀ were protected against subsequent challenge with lethal DEV.【Conclusion】We successfully constructed a DEV mutant with 3 513 bp deletion, and firstly confirmed that the deletion of the 3 513 bp had no effect on virus replication in cells and immunogenicity in ducks. Moreover, the 3 513 bp was associated with DEV virulence.     

The Helper Activities of Different Avian Viruses for Propagation of Recombinant Avian Adeno-Associated Virus

To compare the helper activities of different avian viruses for propagation of recombinant avian adeno-associated virus （rAAAV）, AAV-293 cells were cotransfected with the AAAV vector pAITR-GFP containing green fluorescent protein （GFP） gene, the AAAV helper vector pcDNA-ARC expressing the rep and cap genes, and the adenovirus helper vector pHelper expressing Ad5 E2A, E4, and VA-RNA genes. Chicken embryonic fibroblast （CEF） or chicken embryonic liver （CEL） cells were cotransfected with the AAAV vector and the AAAV helper vector, followed by infection with Marek＇s disease virus （MDV）, avian adenovirus, chicken embryo lethal orphan （CELO） virus or infectious bursal disease virus （IBDV）. Infectious rAAAV particles generated by the two strategies were harvested and titrated on CEF and CEL cells. A significantly higher viral titer was obtained with the helper activity provided by the pHelper vector than by MDV or CELO virus. Further experiments showed that rAAAV-mediated green fluorescent protein （gfp） expression was overtly enhanced by MDV or CELO virus super infection or treatment with sodium butyric acid, but not by IBDV super infection. These data demonstrated that MDV and CELO viruses could provide weak helper activity for propagation of rAAAV, and rAAAV- mediated transgene expression could be enhanced by super infection with the helper viruses.     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测#br#

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Western blot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStar Protean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20-Leu25、Ser40-Met47、Leu68-Ile78、Val124-Phe128、Ile129-Tyr134、Asp176-Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Western blot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Western blot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。