Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究

通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID₅₀间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×10⁶ mL^-1。     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定

U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件, 而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166bp), 采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子, 其长度分别为672、468、358、280、202和105bp, 并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示, 克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5Ps启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录, 棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短, 其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性, 而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求, 而且会提高sgRNA的转录水平, 进而可能提高基因组编辑效率。     

动物细胞无血清培养技术研究进展

生物医药是21世纪的朝阳产业,动物细胞无血清培养技术在生物医药领域中发挥着重要作用。无血清培养技术包括无血清培养基的开发、适应细胞株的驯化以及细胞规模化培养技术等关键技术,以细胞生物反应器高密度培养技术作为基础的细胞无血清悬浮培养技术推动了生物制药的快速发展。     

细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株基因组全长cDNA的构建

试验旨在通过反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV₉疫苗株,为中国农牧区的狂犬病和包虫病的有效防控提供技术手段。本试验参照狂犬病病毒SRV₉株全基因组序列,利用基因合成技术分别合成狂犬病病毒的结构蛋白N、P、L基因,以及N-P-M基因融合片段和狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因与增强型绿色荧光蛋白eGFP融合片段基因,通过载体酶切插入连接方法,依次将狂犬病病毒L基因、N-P-M基因融合片段和G+EgM123+eGFP基因融合片段重组于pcDNA3.1（-）表达载体上,构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV₉全长cDNA。将合成的基因分别构建于pcDNA3.1（-）表达载体,经转化、质粒酶切、基因测序鉴定结果表明,狂犬病病毒N、P、L、N+P+M和G+EgM123+eGFP基因片段长度分别为1 365、1 107、6 471、3 160和3 256 bp;EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段长度为12 465 bp,各基因片段测序结果为100%。本试验成功构建了EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段和狂犬病病毒N、P、L基因的真核表达载体,为通过反向遗传学拯救EgM123基因重组狂犬病病毒及狂犬病和包虫病二联基因重组口服活疫苗的研制提供参考。     

钠盐胁迫对5种白刺种子耐盐性影响对比分析

为治理盐碱地并了解白刺植物耐盐生理能力的差异,以5 种白刺植物种子和不同浓度的钠盐介质为试验材料,采用选种子消毒,再用温水浸泡种子24~48 h 吸水膨胀,培养箱种子培养等方法,施以不同浓度的NaCl 介质对5 种白刺植物种子发芽的影响程度进行研究。结果表明,不同钠盐浓度对5 种白刺种子的绝对发芽率、相对发芽率及发芽指数等指标产生不同影响,其中,钠盐浓度在0~10 g/L 时,5 种白刺种子的绝对发芽率与相对发芽率除西伯利亚白刺外,其余4 种的走势逐渐增大;钠盐浓度在10~25 g/L 时,5 种白刺种子的绝对发芽率与相对发芽率都逐渐降低的变化趋势。钠盐浓度在0~5 g/L 时,发芽指数都逐渐增大,而钠盐浓度在5~10 g/L 时,除盐生白刺、唐古特白刺逐渐增大外,其余3 种发芽指数逐渐降低,说明这2 种白刺的抗盐能力最强。通过对5 种白刺种子的耐盐性对比分析,进一步掌握白刺幼苗在不同浓度钠盐胁迫下的生长及生理响应,为干旱区盐碱地改良的生物措施和受损生态系统的植被恢复提供科学依据。