鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Westernblot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStarProtean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20—Leu25、Ser40—Met47、Leu68—Ile78、Val124—Phe128、Ile129—Tyr134、Asp176—Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。     

肝片吸虫CatL1D蛋白的免疫原性研究

【目的】研究绵羊肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)CatL1D蛋白的分子特征和免疫原性。【方法】利用RT-PCR技术扩增出CatL1D基因,用相关软件分析其编码蛋白的生物学信息。将CatL1D基因克隆入表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-CatL1D,进行BamHⅠ/XhoⅠ双酶切和测序鉴定。将pET-CatL1D载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析;以纯化后的重组蛋白CatL1D为抗原免疫小鼠,利用间接ELISA方法检测抗体效价,分析其免疫原性。【结果】成功克隆了CatL1D基因,该基因全长981 bp,编码326个氨基酸,其中第21-79位氨基酸为组织蛋白酶前肽抑制剂结构域,第108-321位氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶保守结构域;CatL1D蛋白含有6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、11个豆蔻酰化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点,含有10个优势抗原表位。成功构建了pET-CatL1D原核表达载体,诱导表达出CatL1D重组蛋白;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白CatL1D分子质量为51 ku,以包涵体的形式表达,具有较强的反应原性。间接ELISA法检测结果表明,重组蛋白CatL1D免疫小鼠血清抗体效价可达1∶102 400,证实其具有良好的免疫原性。【结论】Fh重组蛋白CatL1D具有较强的抗原性,有开发为早期诊断抗原和亚单位疫苗的潜力。     

禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白的真核表达与抗原性分析

【目的】为获得禽戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）中国分离株（CaHEV）ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析。【方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位区。【结果】SDS-PAGE、Western blot和IFA 结果表明CaHEV ORF3蛋白被成功表达且存在细胞内,昆虫细胞在接毒后4天表达量最高。将ORF3重组蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA方法,对制备的多抗倍比稀释检测,效价达到104,Western blot 和ELISA分析表明ORF3蛋白C端74-88氨基酸处具有较强的抗原性。【结论】本试验用Bac-to-bac系统成功构建含有CaHEV ORF3基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到表达,其主要抗原表位位于C端74-88氨基酸,为进一步研究禽HEV ORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

日本血吸虫Sj CyclophilinA基因的克隆、表达及其生物学功能研究

【目的】克隆和表达了日本血吸虫CyclophilinA(Sj CyPA)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,PCR扩增一EST序列的基因全长cDNA,提交到NCBI,登录号为GQ403666。应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达。诱导、表达、纯化和复性重组蛋白,测定其PPIase活性。利用Western blot检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。【结果】PCR获得了Sj CyPA编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为519bp。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在13d童虫表达量最高,为童虫期高表达基因。构建了重组表达质粒pET28a(+)-Sj CyPA,并在大肠杆菌中成功表达。复性重组蛋白具有PPIase活性。Western blot试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得18.72%的减虫率和44.6%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPA基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPA原核重组表达质粒,在大肠杆菌中成功表达,纯化复性得到有PPIase活性的Sj CyPA重组蛋白,并证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

日本血吸虫SjPRMT1基因的克隆、表达及表达产物的免疫保护效果分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫精氨酸甲基转移酶1(SjPRMT1)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7d童虫消减cDNA文库中,获得一个EST序列,经序列测定和生物信息学分析命名为SjPRMT1,以SjcDNA为模板,获得其全长cDNA。荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况。以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果。【结果】获得了SjPRMT1编码基因的全长cDNA,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸。荧光实时定量PCR分析该基因在18d童虫高表达,13和23d次之。获得了SjPRMT1重组蛋白,其具有良好的抗原性和免疫原性。在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得35.07%的减虫率和48.66%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的SjPRMT1基因的全长cDNA,成功构建了pET28a(+)-SjPRMT1重组质粒,该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

边缘革蜱Dm 86基因表达及免疫原性分析

【目的】 研究Bm86同系物Dm86基因及其编码蛋白,为抗边缘革蜱疫苗候选抗原提供基础。【方法】 以边缘革蜱饱血雌蜱cDNA为模板扩增克隆Dm86基因,分析生物学特性及生活史各阶段表达水平,截短基因构建重组质粒,经IPTG诱导后SDS-PAGE鉴定,纯化蛋白,制备多克隆抗体进行Western Blotting 鉴定。【结果】 PCR扩增获得了1 773 bp目的片段,Dm86蛋白由591个氨基酸组成,分子量为64 857.81,理论等电点为6.78,酸性,具有不稳定性、亲水性和多个B细胞抗原表位;Dm86基因在边缘革蜱不同阶段均有不同程度的表达,饱血蜱阶段的表达量较高;重组蛋白大小为39kDa,以包涵体形式表达;抗体效价可达1∶25 600,能够识别重组蛋白。【结论】 Dm86重组蛋白具有一定的反应原性和免疫原性。     

H9N2亚型禽流感病毒河南株NP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆H9N2亚型禽流感病毒(AIV)河南株核蛋白(NP)基因,并将NP主要抗原表位区在大肠杆菌中进行表达,为禽流感基因工程诊断抗原的制备和开发奠定基础。【方法】根据GenBank公布的禽流感病毒NP基因序列设计引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从H9N2亚型AIV河南株感染的鸡胚尿囊液RNA中扩增AIV河南株NP全基因,将扩增的PCR产物克隆到pGEM-T easy载体并进行测序。通过PCR和酶切方法将NP主要抗原表位区亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达重组蛋白。【结果】测序结果表明,克隆的H9N2亚型AIV河南株NP基因全长为1497bp,包含1个完整读码框,编码498个氨基酸,与GenBank中不同来源、不同亚型的其他7株禽流感病毒NP基因的核苷酸同源性达到95%以上,氨基酸同源性达到98%以上。SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为42 ku的重组蛋白。经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h时,重组蛋白的表达量最高。Western blot分析表明,重组蛋白能够与H9亚型AIV阳性血清发生特异反应。【结论】NP基因非常保守,建立的表达系统能够表达NP蛋白且表达蛋白具有良好的免疫原性。     

猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792E基因主要抗原域的原核表达及抗原性鉴定

对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础.结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒 pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Roetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性.     

牦牛源多杀性巴氏杆菌ompH基因原核表达及抗原性鉴定

[目的]克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性.[方法]扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a - ompH,转化大肠杆菌BL21( DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性.[结果]成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a - ompH原核表达载体.诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性.[结论]ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础.     

狂犬病毒G基因主要抗原表位区（Rmg）的表达及纯化

【目的】对狂犬病毒Rmg基因进行克隆、表达、纯化及复性,以期获得表达量高、反应原性好的Rmg蛋白,为研制快速、直观、简便检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条奠定基础。【方法】用常规PCR从狂犬病毒基因组中克隆出狂犬病毒G蛋白的主要抗原表位基因Rmg,并将其插入原核表达载体pET-Trx中,构建原核表达质粒pET-Trx-Rmg,将pET-Trx-Rmg转化BL21（DE3）plysS,在IPTG诱导下进行表达。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Rmg基因在BL21（DE3）plysS中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的30.5%左右,并主要以不溶的包涵体形式存在,分子量约为51.7 kDa。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达99.1%。经Western blotting检测,发现表达的Rmg蛋白能够与狂犬病毒高免血清发生特异反应,但与犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清不发生反应。【结论】Rmg蛋白具有良好的抗原性,可用于研制检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒结构蛋白基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

[目的]以免疫信息学和反向疫苗学为理论根据,应用生物信息学相关软件和方法,对BVDV结构蛋白( Structural Protein,SP)的二级结构的不同方面及其B细胞表位进行了预测,综合评价了BVDV结构蛋白的抗原特异性细胞表位,并计算出一些潜在的抗原位点.[方法]利用RT- PCR扩增法获得牛病毒性腹泻病毒结构蛋白序列,通过克隆、测序分析结构蛋白基因的基因组序列和蛋白序列,采用DNAStar Protean软件对结构蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布.[结果]P14、gp48和gp53蛋白含有的细胞优势抗原表位较多,有的甚至有可能成为优势抗原表位或对优势抗原表位有协同作用.[结论]与已鉴定的B细胞抗原表位相比,试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法.     

血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒（FAdV-4） Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体，为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化，截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段， PCR扩增其基因序列，连接至pET-32a（+）构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化，并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合，利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性细胞株，再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统，获得大小约为67 kD的 Fiber-2截短蛋白，以包涵体的形式出现，经纯化后可获得单一的特异性条带，经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（2C2、 4F6、 5A5、 6G10和10B5），其抗体分泌稳定性、特异性好，诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400，腹水抗体效价为1:320000~1:1280000，秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、 4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa链； 5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型，轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系 （LMH）进行IFA检测，结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。     

斑马鱼血管新生相关因子PTPRB的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。