兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与免疫原性鉴定

[目的]研究兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与蛋白免疫原性鉴定.[方法]根据GenBank公布的多杀性巴氏杆菌序列AE004439设计引物,经PCR扩增出兔源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA基因,开放阅读框包含l 062 bp碱基,插入到pGEX-6p-1质粒,构建成功重组表达载体pGEX-dompA,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导高效表达出多杀性巴氏杆菌成熟重组外膜蛋白ompA.[结果]表达产物经SDS-PAGE分析,重组多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA分子量在63 ku,Western blot分析显示,重组蛋白能与兔抗多杀性巴氏杆菌高免血清呈现免疫反应,表明表达的重组蛋白具有较好的免疫活性.[结论]获得的重组蛋白为家兔多杀性巴氏杆菌病诊断试剂盒和疫苗的进一步研究奠定基础.     

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16SrDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析。结果表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀性巴氏杆菌rpoE基因相似性为100%,分子量22.0ku,理论等电点4.86,属于不稳定、无跨膜结构、无信号肽、有保守结构域和有潜在磷酸化的胞内亲水性蛋白,二级结构α-螺旋占比最高67.02%,三级结构为棒状微弯曲模型,存在多个抗原表位,预测可与10个蛋白存在相互作用。综上,本研究对一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌进行基因分型和rpoE基因进行生物信息分析,为进一步了解西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和探索RpoE蛋白的生物学特性提供数据参考。     

玉米大斑病菌STK1原核表达载体的构建及其表达

【目的】构建玉米大斑病菌STK1原核表达载体并进行表达,以期得到带有His标签的目的蛋白。【方法】根据GenBank中STK1(AY849317)的cDNA序列及原核表达载体pET28a(+)中的多克隆位点设计引物,进行STK1的克隆和原核表达载体的构建。将重组载体在原核表达体系中进行表达。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达,并利用Western blot技术验证该蛋白是否为目的蛋白。【结果】STK1在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在;蛋白的分子量约为40.8kD;经1mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导,9h后蛋白产量达到最高;经Western blot检测该表达产物具有His-6抗原性。【结论】玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中的STK1在大肠杆菌中获得了表达,为今后STK1蛋白的多克隆抗体制备及功能研究奠定基础。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。     

鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A基因表达及抗原性鉴定

根据已发表的Pm70株的序列(GenBank登录号:AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌标准株C48-102的外膜蛋白基因A(ompA),扩增的片段为1062bp。将测序结果与GenBank中多杀性巴氏杆菌P52、PM70、T931317、T94289的ompA序列比对结果表明,核苷酸水平上同源性为89.0%～98.9%;在氨基酸水平上同源性为90.7%～99.2%。全ompA序列在大肠杆菌中干扰蛋白的正常表达,因此截断ompA蛋白的信号肽序列,将去信号肽的ompA基因插入到pPRO-EX-Htb载体上,构建了原核表达载体Htb-ompA,转化BL21,并诱导表达,SDS-PAGE结果表明,表达蛋白约为35kDa,与预期的分子量大小相符。Western-blot结果表明,表达的蛋白具有良好的抗原活性。本研究重组蛋白ompA的获得,为敲除ompA基因多杀性巴氏杆菌突变株的血清学检测奠定基础。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化

本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础.     

棉花GhSP1L基因克隆与表达分析

[目的]棉花Spiral1-LIKE(SP1L)基因(GhSP1L)的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]通过RT-PCR从棉纤维中克隆GhSP1L基因,进行GhSP1L蛋白的功能结构域分析,构建原核表达载体pET28a-GhSP1L,进行蛋白体外诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达情况;RT-PCR检测GhSP1L基因的表达特征.[结果]从陆地棉纤维组织中克隆得到GhSP1L基因的全长cDNA,其开放读码框为318 bp,编码106个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为11.76kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,其N端和C端较为保守,含有SCOP结构域,属于SP1L家族蛋白,能够在其他微管蛋白协助下与微管结合,SPR1的定位可能与其结合的微管结合蛋白相关.构建了pET28a-GhSP1L原核表达载体,并通过体外诱导表达后获得分子质量约为12 kDa左右的重组蛋白GhSP1L;半定量RT-PCR结果表明,GhSP1L基因开花后3d的纤维组织中表达量较高.[结论]GhSP1L基因的克隆、序列分析和表达,重组蛋白的诱导表达,为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建及其表达研究

【目的】为解决医用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)来源的限制,利用基因工程方法构建牦牛Cu,Zn-SOD原核表达系统,为重组牦牛Cu,Zn-SOD作为注射用药奠定基础。【方法】RT-PCR扩增牦牛Cu,Zn-SOD编码基因,构建Cu,Zn-SOD/pET22b(+)重组表达载体,并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、活性染色及邻苯三酚法进行检测,采用BradFord方法测定融合蛋白浓度。【结果】本试验成功获得了牦牛Cu,Zn-SOD cDNA,长456bp,编码152个氨基酸。与普通牛SOD编码基因序列cDNA一致率为99.6%,氨基酸序列一致率为98.7%,表达产物分子质量约为32kD。酶粗提取液比活约为35U·mg-1。重组蛋白浓度0.2772(mg·mL-1)。【结论】本研究成功构建了牦牛Cu,Zn-SOD/pET22b(+)原核表达载体,表达量较高、稳定性强,重组表达产物具有较高生物学活性。     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的 原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

普通烟草铁氧还蛋白I的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.     

家蚕类胰岛素相关肽结合蛋白2（BmIBP2） 的原核表达与组织特异性分析

【目的】从体外表达家蚕中新发现的1个免疫球蛋白超家族成员-类胰岛素相关肽结合蛋白2（BmIBP2）,并制备其多克隆抗体,为进一步深入研究BmIBP2的生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠的总cDNA为模板,利用普通PCR方法,扩增出BmIBP2基因的成熟肽序列;通过构建重组表达质粒pET-28a-BmIBP2对BmIBP2的成熟肽进行重组表达;制备多克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法研究BmIBP2蛋白的组织特异性。【结果】SDS-PAGE电泳分析表达产物发现,重组蛋白rBmIBP2主要以包涵体的形式表达,目的蛋白大小约为30 kD;以兔抗His-tag抗体为一抗进行Western blot检测,结果表明rBmIBP2具有良好的免疫反应性;用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的rBmIBP2,以纯化的rBmIBP2为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,Western blot结果显示家蚕的中肠组织匀浆液中有1条约28 kD大小的条带,大小与BmIBP2成熟肽的蛋白分子量基本一致,而脂肪体、血淋巴、丝腺、精巢及卵巢的组织匀浆液中没有检测到特异反应条带。【结论】成功地实现了BmIBP2在大肠杆菌中的表达和纯化,并获得其多克隆抗体,Western blot结果证明BmIBP2被正确表达,并明确了该蛋白只在家蚕中肠表达的组织特异性。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。