家蚕地方品种线粒体基因组A+T丰富区的序列及分子进化分析

为了研究家蚕线粒体基因组A+T丰富区的结构和家蚕品种的进化,用PCR方法扩增了12个家蚕(Bombyxmori)地方品种线粒体基因组A+T丰富区及其侧翼序列,分离纯化后克隆到pMD18-T载体进行测序。序列分析表明,克隆片段长度约1.1 kb,基因排列顺序与C108线粒体相同,依次为12S rRNA基因3′端、A+T丰富区、tRNAMet、tRNAIle、tRNAGln和ND2基因5′端,在tRNAGln和ND2基因之间有47 bp的非编码区。以日本野桑蚕(Bombyxmandarina)为外群,用Phylip软件包构建了基于12个家蚕品种线粒体基因组A+T丰富区序列的NJ进化树。结果显示,甘肃种单独聚为一群,其进化早于其它11个品种聚成的类群,说明甘肃种是供试家蚕品种中进化最早的品种。这一结果在分子水平上为黄河流域是家蚕品种的发祥地之一提供了证据,也进一步支持了家蚕品种的中国起源说。对A+T丰富区及其侧翼基因的结构分析表明,家蚕线粒体12S rRNA和ND2基因都十分保守,14个品种统计只分别发生1个和2个碱基转换;A+T丰富区中(A+T)比例高达94.9%以上,第27 nt开始有1个T-串结构,长度为16~19 bp不等;同时还根据3个tRNA基因的核苷酸序列推定了其二级结构。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

家蚕、野桑蚕线粒体Cyt b基因片段序列分析及分子进化研究

以家蚕中系一化地理品种延吉、印度多化品种迈索尔、欧系一化品种法 4 0 8油和中国镇江地区野桑蚕为材料 ,采用PCR技术扩增了其线粒体 (mitochondrialDNA ,mtDNA)细胞色素b(cytochromeb ,Cytb)基因 ,测定其 5′端5 91bp的核苷酸序列 ,并从GenBank中调取中系家蚕品种C10 8、夏芳 ,日系家蚕品种青熟 ,韩国家蚕品种Backokjam和日本野桑蚕的相应序列 ,进行同源性比较 ,发现日系家蚕品种青熟 ,印度家蚕品种迈索尔 ,欧系家蚕品种法 4 0 8油 ,韩国家蚕品种Backokjam和中系家蚕品种C10 8、延吉序列间的同源性最高 ,相互间均为 10 0 % ;日本野桑蚕与各家蚕品种序列间的同源性约 94 %～ 95 % ;中国野桑蚕与各家蚕品种序列间同源性约 98%～ 99%。分子进化树分析显示日本野桑蚕和各家蚕品种相应序列的分歧时间远远早于中国野桑蚕与各家蚕品种序列的分歧时间 ,这是在分子水平上证实家蚕起源于中国野桑蚕的证据之一。     

全国桑蚕一代杂交种质量调查及行业标准实施评价Ⅰ.春用一代杂交种总体质量及评价

连续 5年对全国主产省 (市、区 )的蚕种进行了质量监督抽检 ,检验结果表明 :我国春用桑蚕一代杂交种总体质量良好 ,蚕种质量逐年稳步上升。分析桑蚕一代杂交种总体质量及各指标的测试成绩后认为 :散卵种良卵率≥ 97%、杂交率≥ 95 %、病卵率 <0 15 %的指标比较合理 ,而平附种良卵率≥ 90 %的指标偏低 ,可提高到 94 %～95 % ;实用孵化率≥ 90 %的指标偏低 ,可提高到 92 %以上 ;良卵 (粒 )数指标可改为规定下限 ,如每盒蚕种不少于多少粒 ,允许有不同的卵量 ;蚕种外观包装的标签上还可添加注册商标、执行标准、良卵 (粒 )数 ,春用种须标明出库日期、夏秋用种还须标明浸酸日期等。     

全国桑蚕一代杂交种质量调查及行业标准实施评价Ⅱ.良卵率、良卵数调查及评价

依据 1999- 2 0 0 3年监督抽查春用桑蚕一代杂交种质量的检验结果 ,分析良卵率和良卵数质量指标的测试成绩认为 :散卵种良卵率≥ 97%的指标比较合理 ,而平附种良卵率≥ 90 %的指标偏低 ,可提高到 94 %～ 95 % ;良卵数 (粒 ) /盒 (张 )连续 5年合格率都在 5 0 %以下 ,说明这一指标不适合目前的生产情况 ,可考虑将这一指标改为规定下限 ,允许有不同的卵量。     

家蚕山梨醇脱氢酶基因的转录水平特性分析

为了探究家蚕山梨醇脱氢酶基因（BmSDH）在家蚕各发育时期和组织的转录水平,根据家蚕二化性品种子代滞育性受亲代胚胎期催青条件调控的原理,利用半定量RT-PCR分析25.0℃常温明催青和17.5℃低温暗催青对家蚕品种“秋丰”各发育时期蚕体和组织中BmSDH转录水平的影响.结果显示,BmSDH-1、BmSDH-2a和BmS-DH-2b在家蚕的各个发育阶段均有表达：在幼虫期5龄3d,BmSDH-1在常温明催青组脂肪体中转录水平较高;BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下的血液、脂肪体和卵巢中转录水平均高于低温暗催青;在蛹期3d,BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下血液和卵巢中的转录水平均低于低温暗催青;在次代卵产下后6～24h期间,BmSDH-2a和BmSDH-2b的转录水平逐渐升高.因此,BmSDH-1和蚕卵滞育与否没有直接关系,而BmSDH-2a和BmSDH-2b与家蚕二化性品种卵滞育与否有重要的平行关系,为从分子水平阐明家蚕滞育的分子机制积累了试验数据.     

柞蚕催青期胚胎发育阶段的蚕卵磷脂含量

磷脂是一种功能性和结构性兼有的活性物质,在生命活动中具有重要生理功能.在所有的生物组织中,都含有一定量的磷脂.随着生物体发育、生长、衰老和死亡,与其他一些生物活性物质(如酶、碳水化合物等)一样,体内的磷脂进行代谢,从而导致不同时期的生物体的磷脂含量及其组分会相应地发生变化.在生物体遭受病害、中毒、低温等不良环境影响时,生物体内的磷脂含量及其组分也会改变.     

用铬变素2R法对家蚕微孢子虫孢子染色的研究

采用铬变素 2R法 (Chromotrope 2R)染色家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)孢子和绿僵 (Nomuraearile yi)孢子、曲霉 (Aspergillusflavus)孢子、花粉粒 (Pollengranule)等与N .b孢子形状相似物 ,结果表明 :Chromotrope 2R法特异性地将N .b孢子染成粉红色 ,绿僵孢子、曲霉孢子、花粉粒未被染成红色 ,初步认为Chromotrope 2R法可应用于母蛾镜检的N .b鉴定 ,能明显提高N .b的检出率与准确性 ;染色N .b孢子的最佳时间与温度为 4 0min ,30℃。鉴于本染色法的条件、技术操作简便 ,染色特异性强 ,因而具有良好的应用前景     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

野桑蚕、家蚕海藻糖酶基因5''侧翼区的克隆与序列分析

海藻糖是一种双糖,广泛存在于包括细菌、酵母、植物和无脊椎动物在内的生物体内,主要功能是储备生物代谢所需的能源.在昆虫血液中,海藻糖是一种最重要的糖类,具有供给能量和提供合成生物大分子的底物等功能.其功能主要是通过海藻糖酶(Trehalase)的作用来实现的.家蚕海藻糖酶有可溶型和膜固定型两种类型,可溶型主要存在于蛹期中肠,而膜固定型存在于包括卵巢在内的多种组织.这两种类型酶是由同一个基因表达而形成不同的成熟海藻糖酶.海藻糖酶膜固定型存在于向血液面的卵巢膜内,该基因的表达是由滞育激素诱导调控.卵母细胞通过位于膜内的海藻糖酶,将血液中海藻糖降解成葡萄糖,然后吸收到胞内,最后合成糖原,从而导致蚕卵的滞育.从而海藻糖酶基因是从分子水平来解明家蚕滞育机理的一个重要途径.本实验从野桑蚕、家蚕苏@菊×明@虎基因组中分别克隆了野桑蚕和家蚕的海藻糖酶基因的5′侧翼区片段并进行了测序分析,以供进一步的启动子功能研究,现报道如下.