细菌CHB101抑制油菜菌核病菌的机理研究

通过比较菌丝形态，以及几丁质酶活性变化与抑菌能力相关性研究，得出如下结论：油菜菌核病菌在CHB101菌和其浓缩培养液作用下，菌丝出现细胞壁渍解、细胞质凝聚成颗粒状并外渗、侧面产生圆形小孢子等相同形态变化；培养液中几丁质酶活性越强，对油菜菌核病菌核萌发及菌丝生长的抑制能力越强。初步结论，CHB101菌抑制油菜菌核病的能力与其胞外几丁质酶活性成显著正相关。     

烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究

采用间接ELISA和RT-PCR，建立了烟草芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）快速检测的技术体系。间接ELISA测定结果表明，TuMV多抗按1：3000浓度稀释后，具有较高的检测灵敏度，其检测极限浓度为1：3215；通过改进RNA提取技术，从少量的烟草病叶中提取出高质量总RNA，进行cDNA合成及PCR扩增，得到一条长度约986bp的特异PCR扩增产物，与理论设计的大小一致，可有效地对田间烟株进行快速检测。     

本氏烟NbMBF1c的克隆、表达及在TMV侵染过程中的功能

【目的】烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）是危害茄科、十字花科、葫芦科等农作物的重要病毒,给农业生产造成了巨大损失。通过分子克隆获得本氏烟（Nicotiana benthamiana）多蛋白桥梁因子1c（multiprotein bridging factor 1c,MBF1c）,综合应用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段,明确NbMBF1c的抗病毒功能和机制,为作物的抗病毒育种提供理论依据。【方法】根据Sol Genomics Network中报道的NbMBF1c序列全长,设计引物克隆NbMBF1c全长序列;使用GeneDoc及MEGA X对NbMBF1c蛋白和其他物种中的同源蛋白序列进行比对并构建系统进化树;利用生物信息学分析NbMBF1c的基因特征和蛋白结构;使用实时荧光定量PCR检测其组织表达及其在TMV侵染中的表达;利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默NbMBF1c后通过摩擦接种TMV-GFP,明确NbMBF1c对病毒侵染的影响;构建pART27-GFP-NbMBF1c和pART27-Myc-NbMBF1c瞬时过表达载体,在本氏烟叶片中表达融合蛋白GFP-NbMBF1c后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位,表达融合蛋白Myc-NbMBF1c后接种病毒观察TMV-GFP侵染情况;采用实时荧光定量PCR检测沉默NbMBF1c后相关激素基因的表达,分析NbMBF1c影响病毒侵染的机制。【结果】NbMBF1c全长441 bp,编码146个氨基酸,包含一个保守结构域HTH（helix-turn-helix）;系统发育分析表明,NbMBF1c与绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）MBF1c（XP_009614458.1）亲缘关系最近;NbMBF1c的表达具有特异性,在根中的表达量最高,其次是茎、叶和花;NbMBF1c定位于细胞质和细胞核中;沉默NbMBF1c会显著影响本氏烟株高,出现矮化等症状,接种TMV-GFP第5天时,沉默处理相较于对照组植株新叶病毒含量更高;瞬时过表达Myc-NbMBF1c融合蛋白,在注射叶接种TMV-GFP后,病毒侵染减少,但NbMBF1c并不与TMV组分互作;沉默NbMBF1c后,脱落酸（abscisic acid,ABA）合成关键酶基因NCED3、脱落酸受体PYL1、ABA信号转导因子ABAI1和蛋白激酶SnRK2E的表达量显著上调;茉莉酸（jasmonic acid,JA）合成途径AOS1上调表达,茉莉酸信号通路上的受体COI1下调表达。【结论】本氏烟MBF1家族NbMBF1c的表达受TMV侵染诱导,且主要定位于细胞质和细胞核。NbMBF1c作为植物抗TMV的正调控因子抑制病毒在本氏烟上的侵染。NbMBF1c不通过与TMV组分互作来抑制病毒侵染,而是通过调控植物激素的产生和信号传导来抑制病毒侵染。     

重庆地区马铃薯上黄瓜花叶病毒的检测及亚组鉴定

采用抗原直接包被ELISA对采自重庆11个马铃薯主产区的259份马铃薯病毒病样品进行了黄瓜花叶病毒 Cucumbermosaicvirus,CMV的检测及亚组鉴定.共有233份样品检测到CMV,总检出率达91.60%;其中属 CMV Ⅰ亚组的样品为197份,占84.55%;另36份样品为CMV Ⅱ亚组侵染,占15.45%;未检测到CMV Ⅰ和 CMV Ⅱ的复合侵染.这些结果表明,CMV Ⅰ是重庆地区马铃薯上的优势CMV亚组类型.     

马铃薯早疫病菌的分离鉴定和生物学特性研究

采用组织分离法对重庆市巫溪县马铃薯早疫病病原菌进行分离鉴定,并对该菌的生物学特性进行研究。结果表明：重庆地区马铃薯早疫病菌丝有横隔和分支|分生孢子梗单生或丛生|分生孢子倒棒状或手雷形,大小为（46.32～156.33）μm×（11.58～28.95）μm,具纵横隔膜。结合rDNA-ITS序列分析,确定为茄链格孢菌（Alternaria sonali Sorauer）。生物学特性研究表明,光照对菌丝生长影响不显著,但黑暗条件有利于产孢|菌丝生长最适温度为27～28 ℃,最适pH值为6|分生孢子萌发最适温度为30 ℃,最适pH值为7～8。营养特性研究表明,蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖和淀粉都比葡萄糖更有利于菌丝生长,其中蔗糖、果糖、乳糖效果较好|甘氨酸和硝态氮能促进菌丝生长,铵态氮抑制菌丝生长。     

甜橙和柚中CTV强弱毒株系p20的遗传变异

【目的】对7个柑橘衰退病毒(CTV)株系进行遗传变异研究,明确寄主甜橙和柚中CTV强弱毒株系p20的变异水平。【方法】运用RT-PCR、克隆及测序等技术建立CTV p20种群,并借助MEGA6构建单倍型系统发育树,运用软件DNAStar对两种寄主中CTV强弱毒种群的遗传结构、变异水平进行分析,运用DnaSP软件对各种群进行单倍型多样性、核苷酸多样性分析和中性检验分析。【结果】构建了7个CTV p20种群,由162条序列构成,包含11个单倍型,单个种群有1个或更多单倍型出现。序列分析发现,来自不同种群的单倍型对应的原始核苷酸序列一致性为88.2%—100.0%,对应的氨基酸序列的一致性为92.3%—100.0%,最低的氨基酸序列一致性发生在CT23-1和CT9-2之间;其中单倍型PeraIAC-4、CT22和CT9-1共有50条序列,对应的原始核苷酸序列一致性为100.0%,属优势单倍型,与标准株系T36亲缘关系较近;单倍型多样性最丰富的是甜橙种群PeraIAC,单倍型多样性为0.800,而单倍型多样性最低的是柚种群CT22,单倍型多样性为0.170;相比柚种群的单倍型多样性(0.170—0.552)和核苷酸多样性(0.00032—0.05919),甜橙种群具有更为丰富的单倍型多样性(0.513—0.800)和核苷酸多样性(0.04208—0.05677)。系统发育树分析表明,来自甜橙的分离株种群结构复杂,甜橙种群中检测到的单倍型与标准株系T30、T36、VT和T3均有相关性;与标准株系T3相距很近的CT31-2与优势单倍型在系统发育树上距离最远,对应的原始核苷酸序列一致性仅为88.3%。中性检验结果表明,CTV甜橙种群趋于平衡或收缩状态,而CTV柚种群除CT23外则趋于扩张状态;其中TR-514Y、CT31和CT23种群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均为正值且达到显著水平,而CT9种群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均为负值且达到显著水平。运用DnaSP软件对各种群进行重组分析表明,在各种群中均未检测到重组事件发生。种群变异分析发现,各种群突变克隆百分比在0—30.8%,碱基突变频率在0—7.706×10~(-4),其中CTV甜橙强毒种群有最高的突变克隆百分比(30.8%),最高的碱基突变频率(7.706×10~(-4)),最多的碱基突变数量(11个)和最多的突变位点(7个);CTV甜橙弱毒种群的突变克隆百分比和碱基突变频率均明显低于甜橙强毒种群,CTV柚弱毒种群的突变克隆百分比和碱基突变频率略低于柚强毒种群。碱基突变类型分析发现碱基突变以碱基替代为主,其中A→G突变为优势类型,仅在柚强毒种群CT3的156和157位点间检测到一个碱基插入突变类型,为碱基A插入,未检测到碱基缺失突变类型。【结论】在寄主甜橙和柚中CTV强弱毒p20种群结构及变异存在差异,CTV甜橙种群有着更复杂的种群结构和更高的种群变异水平,且CTV强毒种群变异更大。     

马铃薯干腐病菌拮抗放线菌JY-22的抑菌作用及菌株鉴定

为了进一步明确拮抗放线菌JY-22对马铃薯干腐病的生防潜力,采用生长速率法和孢子萌发法测定了JY-22无菌发酵液(JY-22SFB)对马铃薯干腐病菌的抑菌作用及抑菌活性稳定性。JY-22SFB原液对马铃薯干腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有很强的抑制作用,抑制率分别为74.5%和100%,其中对孢子萌发的抑制效果与浓度为30 mg/mL的化学药剂50%多菌灵相当。JY-22SFB处理后马铃薯干腐病菌菌丝生长畸形、易断裂。JY-22SFB对热处理和紫外线照射处理具有很好的稳定性,水浴80℃处理3 h和紫外线照射30 min对其抑菌活性没有影响。JY-22SFB浸泡处理可明显降低马铃薯干腐病菌的致病性。通过形态和分子鉴定,确定该菌属链霉菌属吸水链霉菌Streptomy-ces hygroscopicus。研究表明菌株JY-22在马铃薯干腐病生物防治中具有潜在的利用价值。     

重庆长寿夏橙病害的诊断及防治

夏橙Citrus sinensis Osbeck是世界上重要的淡季水果和橙汁加工的重要原料,也是目前世界上发展规模最大的一类晚熟甜橙品种.重庆地处三峡库区腹心,属典型的中亚热带湿润季风气候,是我国甜橙最适生态区之一,适宜夏橙的生长.长寿湖区是目前全国规模最大的夏橙生产基地,种植面积已达0.28万hm2,投产面积0.13万hm2,年产量3.5万t,成为长寿农业的支柱产业之一.     

《植物检疫》课程教学改革对学生专业素质拓展的探索

专业素质是大学生素质结构中的核心素质元素。教学过程中拓展学生的专业素质是专业课的重要内容。根据《植物检疫》课程的特点,在教学过程中尝试运用新的教学模式,让学生参与课程建设、课堂教学、教学实践和课程考核,从不同方面扩大学生的专业知识,提高专业能力,拓展学生的专业素质,达到专业课传授知识、培养能力、提高素质的教学目的。     

番茄SlN-like的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】番茄（Solanum lycopersicum）作为重要的蔬菜作物,其生长受到包括害虫、真菌、细菌和病毒等各种生物因素的危害。明确番茄抗性基因SlN-like的抗病毒功能与机制,为番茄的抗病毒育种与抗病毒药剂的靶向开发提供理论依据。【方法】从茄科植物基因组数据库Solanaceae Genomics Network中获得SlN-like的全长,并将其分为4段,利用融合聚合酶链式反应（fusion PCR）扩增获得SlN-like的序列全长;通过生物信息学分析SlN-like的进化关系、蛋白特征、保守结构域、亚细胞定位以及互作关系;通过实时荧光定量PCR分析SlN-like在番茄根、茎、叶、花和果实中的表达情况及其在烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）侵染后的叶片表达量;借助烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）沉默番茄内源SlN-like,摩擦接种TMV-GFP于沉默植株,明确SlN-like对病毒侵染的影响。实时荧光定量PCR分析沉默植株中脱落酸（abscisic acid）、茉莉酸（jasmonic acid）和乙烯（ethylene）激素相关基因的表达量及SlN-like在外施乙烯利（ethephon,ETH）3、6、12、24 h后的表达情况,最终明确SlN-like调控激素途径响应病毒侵染的机制。【结果】通过分子克隆与融合PCR技术,从番茄品种Micro-Tom中克隆获得全长3 444 bp 的SlN-like,上传至NCBI获得序列号MW792493。通过生物信息学分析发现SlN-like含有TIR、NB-ARC和NACHT结构域,并与马铃薯（Solanum tuberosum）N-like（AAP44394.1）亲缘关系最近。SlN-like在番茄各组织中均有表达,在茎中的表达量最高,其次是根、花,叶和果实中的表达量最低。TMV-GFP侵染番茄后第5、7天SlN-like的表达显著高于PBS处理,分别是PBS处理的1.6和2.2倍,并且TMV-GFP侵染会使SlN-like的表达持续升高。TRV载体介导沉默番茄的SlN-like,发现沉默78.3%的SlN-like不会影响番茄生长表型,但可促进TMV-GFP侵染;实时荧光定量PCR分析发现沉默植株中ERF1的表达显著降低,仅为对照组的12.5%;外施乙烯利处理番茄3 h后SlN-like表达量升高,并在12 h达到最高峰,是对照组的2.71倍,24 h后恢复正常。【结论】番茄SlN-like属NBS-LRR类抗病蛋白,其表达受TMV侵染诱导,沉默SlN-like促进TMV-GFP侵染,降低乙烯相关基因ERF1的表达,而外施乙烯利导致SlN-like的差异表达,揭示了SlN-like作为正调控因子可能影响乙烯途径介导的番茄抗病毒防御。