柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^? RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（C.limon）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

柑橘黄化脉明病毒的TGB基因生物信息学分析及亚细胞定位

柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是一种正义单链RNA病毒。其基因组含有6个开放阅读框(ORF),其中ORF2、ORF3和ORF4组成了三基因连锁结构(triple gene block,TGB)。以感染CYVCV的尤力克柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]植株的总RNA为模板,扩增和克隆了CYVCV的TGB基因,并开展了其编码蛋白的理化性质和分子特性等生物信息学分析;进而通过In-Fusion~?技术构建了TGB各基因的亚细胞定位载体,经农杆菌介导转化洋葱表皮细胞并在荧光显微镜下进行亚细胞定位观察。生物信息学分析结果表明,CYVCV-TGB具有与Potexvirus属病毒TGB相似的理化性质和分子特性,可能参与病毒在寄主中的运动且需要外壳蛋白的参与。亚细胞定位结果显示,TGBp1定位于细胞壁(膜)上,TGBp2和TGBp3主要定位于细胞壁(膜),少量呈星点状定位于细胞内。研究结果为揭示CYVCV在寄主中的运动机理奠定了基础。     

第九届国际柑桔苗木大会简介及与会收获

中国代表团于2011年6月11-25日受邀参加了在阿根廷召开的第九届国际柑桔苗木大会,并对阿根廷及智利两国柑桔产业进行了实地考察。会议主要围绕苗木繁育、新品种和砧木、砧木对比试验以及嫁接传染性病害特别是黄龙病等几个领域开展交流,其中包括种皮剥离,促进柑桔种子萌发技术;美国通过病毒成功矮化柑桔植株;澳大利亚循环水再利用的水肥一体化管理等。此次会议使我们明确：苗木质量是基础,安全保障更重要;开展砧穗组合比较试验,贵在长期坚持不懈;良种创新多元化,注重知识产权保护和品牌打造;标准建园．信息精准．肥水一体;精深加工,扩大出口。做强产业;加强平台建设,提升柑桔工程技术研发水平。     

土霉素对柑橘黄龙病的防治效果及对柑橘产量和品质的影响

为有效防控柑橘黄龙病，于2017年在佛罗里达大学柑橘研究与教育中心的奥本代尔市柑橘试验场进行田间试验筛选黄龙病的防治药剂及其浓度，测定注射土霉素后叶片中柑橘黄龙病菌亚洲种Cadidatus Liberibacter asiaticus、土霉素、淀粉含量、柑橘产量、出汁率、可溶性固形物含量和酸度，显微镜下观察注射土霉素后淀粉粒的分布。结果表明，浓度为1.6g/株土霉素处理180 d后柑橘叶片中黄龙病菌亚洲种含量减少幅度最大，为91.78%；注射浓度为1.6g/株土霉素后7d，叶片中土霉素含量达142.2 μg/kg，注射后11 d叶片中土霉素含量达到最大，为239.8 μg/kg，注射后45 d叶片中土霉素含量低至99.6 μg/kg以下；注射后7~90d，叶片中黄龙病菌亚洲种含量呈波浪形变化，注射90 d后叶片中黄龙病菌亚洲种含量一直处于增长趋势，叶片中黄龙病菌亚洲种含量总体随着土霉素含量的升高而降低；注射浓度为1.6g/株土霉素后，叶片中淀粉含量大幅度下降，60d时达到最低值，为3.3 μg/mm²，90d时达到峰值，为14.5 μg/mm²；单株产量为16.7 kg，与注射浓度为0.8 g/株土霉素处理差异不显著，但均显著高于其它2个处理；柑橘出汁率、可溶性固形物和酸度均与清水对照差异不显著。表明土霉素可有效抑制黄龙病菌亚洲种，减少柑橘叶片内淀粉含量，增加柑橘产量，但对果实品质未产生显著影响。     

PCR法快速检测柑桔溃疡病菌的简易制样技术

采用依据柑桔溃疡病菌独有蛋白基因的保守区段设计的特异性引物及其扩增体系进行测试.4种浸泡液中,浸泡液B的浸提效果最好,最佳浸泡时间为10～15 min.浸提液进行加热灭活与不加热灭活处理,PCR扩增结果无明显差异.对于无症柑桔样品,浸泡液中加入终浓度为0.3%的Na2SO3可以降低植物色素、多元酚和铜制剂残留的Cu2+等抑制PCR反应物质的干扰作用.样品浸提液经过离心处理,不仅可以有效浓缩靶细菌,提高检测灵敏度,而且可以除去PCR反应抑制物质,大大降低了检测的假阴性.     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

PCR、DIA与致病性测定法检测柑桔溃疡病菌的比较

 依据柑桔溃疡病菌全基因组序列的独有保守区域设计筛选出的特异性引物对JYF5/JYR5，用于柑桔溃疡病菌的PCR检测，具有很好的检测特异性、灵敏度和稳定性。同时比较了PCR与DIA（斑点免疫结合技术）及传统的致病性测定法在检测灵敏度、稳定性及田间样品检出率等方面的差异。结果表明，PCR的检测灵敏度可达103～104 cfu·ml-1（每个反应体积约10个细菌），明显高于DIA（104～105 cfu·ml-1，每个样点约300个细菌）；PCR、DIA和致病性测定法检测田间显症样品的检出率均可达到100%，而检测柑桔无症样品的检出率依次降低。此外，通过排除PCR抑制物质和在PCR反应体系中加入终浓度为15%的甘油，有效地降低了检测中存在的假阴性。     

重庆地区柑桔衰退病毒组群分析

柑桔衰退病毒(CTV)存在着许多生物学特性不同的株系。通过铲除感染强毒株植株或利用弱毒株交叉保护的方式来防治柑桔衰退病都需要对CTV株系进行准确、可靠的鉴定。根据对CTV衣壳蛋白基因(CPGs)的限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,发现在重庆地区CTV主要以CP/HinfⅠRFLP第1,3和6组群为主,并且在田间以多株系混合感染为主?     

重庆地区柑桔衰退病毒组群分析

柑桔衰退病毒(CTV)存在着许多生物学特性不同的株系.通过铲除感染强毒株植株或利用弱毒株交叉保护的方式来防治柑桔衰退痛都需要对CTV株系进行准确、可靠的鉴定.根据对CTV衣壳蛋白基因(CPGs)的限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(ssCP)分析,发现在重庆地区CTV主要以CP/Hinf I RFLP第1,3和6组群为主,并且在田间以多株系混合感染为主.     

重庆地区马铃薯上黄瓜花叶病毒的检测及亚组鉴定

采用抗原直接包被ELISA对采自重庆11个马铃薯主产区的259份马铃薯病毒病样品进行了黄瓜花叶病毒 Cucumbermosaicvirus,CMV的检测及亚组鉴定.共有233份样品检测到CMV,总检出率达91.60%;其中属 CMV Ⅰ亚组的样品为197份,占84.55%;另36份样品为CMV Ⅱ亚组侵染,占15.45%;未检测到CMV Ⅰ和 CMV Ⅱ的复合侵染.这些结果表明,CMV Ⅰ是重庆地区马铃薯上的优势CMV亚组类型.