柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer~?RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒(pea enation mosaic virus)和紫花苜蓿耳突病毒(alfalfa enamovirus)的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株(阳性率)分别为16/17(94.12%)、12/14(85.71%)、16/21(76.19%)、15/19(78.95%)、13/14(92.86%)和0/18(0)。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO（AF347695）同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性,并观察到点状褪绿症状;提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段;以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗,通过RT-PCR在90 dpi可检测到CYMV特异性条带;取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察,可见大小约130 nm×30 nm的杆状病毒粒子,说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆。将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种,注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测,结果显示前者侵染率为11.11%—100.00%,后者侵染率为63.16%—90.00%,部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状。通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱,结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株,且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带,表明CYMV可以侵染高粱。构建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为gfp的突变体,通过农杆菌介导注射接种粗柠檬,RT-PCR检测结果均为阴性,且无侵染症状。【结论】成功构建了CYMV的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株,侵染症状在不同品种上具有差异。     

利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆

【目的】构建柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus,CLBV）中国分离株的侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】以GeneArt® pYES1L Vector为模板,PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的三元穿梭载体pCY。以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长,采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY,采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501,通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性,从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系。在此基础上,以CLBV中国分离物（CLBV-HBYD）全长cDNA为模板,分段扩增其基因组,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组。得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性。【结果】建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的三元穿梭载体PCY,该载体全长10 347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点,能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制,可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆,也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主。利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个。随机选取1个克隆进行了序列测定（GenBank登录号：MG572236）,其基因组全长8 747 nt,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1为5 889 nt、ORF2为1 089 nt、ORF3为1 092 nt。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79％-98％,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高,为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在利用MEGA6 软件构建的系统发育树上,CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇,而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇。将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌,以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟。接种20 d后,抽提RNA进行RT-PCR检测,结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带;随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交,结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带,而对照样本未检测到任何条带,表明这些克隆均为侵染性克隆。【结论】构建了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系,利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆。     

植物病毒载体介导的可溶性甲烷单加氧酶B亚单位在蚕豆植物中的表达

用基因操作技术将编码可溶性甲烷单加氧酶B亚单位（Soluble Methane Monoxygermse-B component：SMMO-B）的基因全长序列导入来自三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus；CIYVV）侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W基因组的NIb／CP基因之间，构建了重组病毒克隆pCV—mmoB。用上述重组病毒克隆接种该病毒的自然寄主植物蚕豆，表现了与野生型CIYVV相同的症状。RT—PCR检测结果表明，子代病毒基因组中的外源基因获得了转录。蛋白质杂交（Western blotting；WB）检测结果表明，sMMO—B亚单位蛋白在被重组病毒克隆侵染的寄主植物中获得了表达。     

柑橘溃疡病抗性相关转录因子CitMYB20的功能

【目的】 了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】 根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑（Fortunella japonica）和敏感品种枣阳小叶枳（Poncirus trifoliata）的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】 金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20（GenBank登录号分别为MN689609和MN689608）序列高度保守,相似度达到99%;两者的启动子序列（GenBank登录号分别为MN689611和MN689610）虽然都具有脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件,但金弹金柑中还具有水杨酸响应的顺式作用元件,而枣阳小叶枳中缺少该元件。在体外接种柑橘溃疡病菌5 d时,金弹金柑成熟叶片中CitMYB20表达量显著上升,达到对照的2.5倍;而枣阳小叶枳叶片CitMYB20在整个接菌周期内表达量未发生显著变化。外源激素处理时,CitMYB20对水杨酸和茉莉酸甲酯的响应相似,即在金弹金柑中呈现出先升高后降低的趋势,而在枣阳小叶枳中表达量降低,随后又恢复正常。乙烯利处理时,CitMYB20在金弹金柑中表达量略有下降,在枣阳小叶枳中表达量先升后降。遗传转化共获得7株过表达植株和5株抑制表达植株,转基因植株与对照植株相比在形态发育上未见明显差异。CitMYB20过表达植株能够在一定程度上减弱柑橘溃疡病的症状,而抑制CitMYB20表达植株对柑橘溃疡病菌的敏感性增强。【结论】 CitMYB20在柑橘溃疡病抗性品种中受柑橘溃疡病菌的诱导表达;CitMYB20是防御柑橘溃疡病菌入侵的一种正向调控转录因子,其抗柑橘溃疡病功能可能需要水杨酸和茉莉酸信号途径的作用;CitMYB20可作为柑橘抗溃疡病分子育种的候选基因。     

一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析

【目的】探究侵染掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA,vsiRNA）序列特征,为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料,取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA,并进行小RNA深度测序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列,利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段（reads）,长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度,占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。该病毒分离物的基因组全长为9735 nt,编码3105个氨基酸,其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%,暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示,SMV NN与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近。将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上,分析该病毒的vsiRNA特征,结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度,病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖,且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4,DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1,AGO1）对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切,主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA,从而抑制SMV在植株体内的复制。     

用草本植物番茄鉴定五种柑橘类病毒

【目的】通过嫁接木本指示植物进行柑橘类病毒鉴定需要合适的季节和较长的显症时间,并且柑橘木本指示植物的遗传转化和基因功能验证体系尚不成熟,研究其与寄主间的互作较为困难。因此,寻找合适的草本鉴定和实验寄主对于更好地进行柑橘类病毒的鉴定及研究其与寄主间的互作具有重要意义。论文旨在明确中国报道的5种主要柑橘类病毒,包括柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘曲叶类病毒（Citrus bent leaf viroid,CBLVd）、啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）、柑橘矮化类病毒（Citrus dwarfing viroid,CDVd）和柑橘树皮裂纹类病毒（Citrus bark cracking viroid,CBCVd）对番茄（Solanum lycopersicum）的侵染能力,进而明确其可否作为5种类病毒的鉴别寄主或实验寄主。【方法】将5种柑橘类病毒的野生型分子变种（分别为CEVd.188,长370 nt;CBLVd.032,长328 nt;HSVd.cit106,长296 nt;CVd-III.072,长295 nt;CVd IV Ca,长285 nt）二聚体cDNA克隆质粒（克隆于pGEM-T载体）,采用限制性内切酶Nde I在37℃条件下进行酶切线性化处理,经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定酶切成功后,将该含有目标片段的线性化重组质粒采用T7 RNA多聚酶在37℃条件下进行体外转录,获得类病毒RNA二聚体溶解于1% K2HPO4接种缓冲液中,机械摩擦接种Alisa Craig和 Rutgers番茄（S. lycopersicum var. Alisa Craig和 var. Rutgers）叶片,置于24℃温室条件下培养。接种60 d后,采集新生叶片釆用CTAB法提取番茄叶片总RNA,通过RT-PCR对接种的类病毒进行检测。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目标片段,与pMD18-T载体连接,热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经PCR鉴定后挑取阳性克隆进行序列测定,采用DNAMAN version 6.0软件对获得的cDNA序列进行相似性分析。【结果】线性化质粒体外转录后经琼脂糖凝胶电泳分析显示,每个质粒转录产物均可检测到目标大小的RNA条带。接种后,RT-PCR检测显示5种类病毒侵染率表现出显著差异,CEVd、CDVd和HSVd可以侵染大部分接种植株（侵染率分别为7/8、5/8和7/8）。从接种成功的植株样品中对所接种类病毒后代的cDNA克隆和序列测定显示,随机测定的5-10个克隆中均能找到与接种类病毒cDNA一致的核苷酸序列,后代序列与接种序列间的相似性在99.7%以上;后代分子变异分析显示变异位点小于10个,变异率小于0.3%;而 CBLVd和CBCVd不能侵染或侵染率很低（0或1/8）。【结论】CEVd、CDVd和HSVd能够侵染Rutgers和Alisa Craig番茄,2种番茄均可以作为3种类病毒的草本鉴定和实验寄主;而 CBLVd和CBCVd 难于侵染Rutgers和Alisa Craig番茄。在接种的Alisa Craig番茄品种上,各类病毒接种植株均比接种缓冲液对照表现显著的矮化效果;在Rutgers植株上,仅有接种了CEVd的植株表现较对照的矮化效果。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。     

侵染萝卜的油菜花叶病毒广东分离物分子特征及其致病性分析

【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一,严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类,探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性,为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品,提取样品总RNA,利用小RNA深度测序初步探明病毒种类,然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3 405 nt片段和3 194—6 304 nt片段,然后通过同源重组克隆到pCB301双元载体上,得到YoMV-GD分离物基因组全长序列,同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟,检验pCB301-YoMV-GD的侵染性,然后再注射接种萝卜和菜心,测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3（Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3）、萝卜黄病毒1（Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1）、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、YoMV 4种;YoMV-GD分离物全长序列为6 304 nt,编码4个蛋白,分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP,与YoMV英国分离物（GenBank登录号：AY318866）核苷酸相似性最高,为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近;构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟,引起严重的坏死、枯斑等症状,具有较强的侵染性;YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心,引起轻微的黄化和花叶等症状,致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV,且以复合侵染形式存在;YoMV遗传进化并没有明显的地域性;YoMV-GD对烟草致病力较强,而对萝卜和菜心致病力较弱。     

基于cpInDel标记和cpSSR标记的柑橘属及近缘属植物亲缘关系

【目的】通过对柑橘叶绿体基因组变异位点的研究,从胞质层面揭示柑橘类果树的遗传进化,为柑橘种质资源的收集、评价和利用提供参考。【方法】以甜橙叶绿体高变区序列为参考,利用已发表的二代基因组测序数据对代表性的柑橘属及其近缘属材料进行De Novo组装,获得叶绿体基因组高变区组装序列,通过序列比对,发掘代表性材料的差异位点,针对差异位点设计cpInDel引物。对甜橙叶绿体基因组两个及以上核苷酸重复构成的SSR位点进行定位分析,找出代表性材料间有差异的位点,针对差异位点设计cpSSR引物。选择在分类学和/或起源研究上有代表性的柑橘属及近缘属材料48份,利用新开发的cpInDel、cpSSR标记和已报道的cpSSR标记进行扩增检测、电泳谱带分析和聚类分析。【结果】本研究新开发4个cpInDel标记和13个cpSSR标记。扩增检测显示,这些标记在48份试验材料中均能扩增出较为清晰的多态性条带;但cpInDel标记扩增出的条带更为单一,类群区分时,仅通过单个标记便能实现对某一类群或几个类群的区分,具有更好的区分效果。聚类分析显示,cpInDel和cpSSR标记得到了比较类似的结果,但在小类群关系以及部分材料的归类上存在差异。二者均揭示枸橼类柠檬-藜檬-来檬杂种的胞质来源并非香橼,枳杂种的胞质也并非枳,显示宽皮柑橘类黄柑的代表性品种‘旺苍皱皮柑’有不同于宽皮柑橘类其他品种的胞质来源,‘资阳香橙’和‘韩国香橙’胞质差异明显。针对宽皮柑橘类、甜橙-酸橙类和宜昌橙-大翼橙类3个小类群的相互关系,cpInDel显示它们关系较近,而cpSSR则将它们归为独立的类群;cpInDel标记将印度野橘归于真正的枸橼类,cpSSR将其单独聚为一类。【结论】叶绿体基因组分子标记分析能从胞质角度揭示不同于核基因组的柑橘属及近缘属植物的亲缘关系,但若与核基因组分子标记分析相结合,能更全面地揭示材料间的亲缘关系,更准确地鉴定柑橘种质资源。     

钙对枳生长发育及柑橘溃疡病抗性的影响

【背景】柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘致病变种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的细菌性病害,可侵染枝、叶、果,危害几乎所有的柑橘主栽品种。前期对湖南省39个柑橘园的调查结果显示柑橘果园土壤酸化和交换性钙缺乏严重,叶片中均存在钙缺乏现象。钙是植物所需大量元素之一,钙缺乏会造成植物营养失衡,生长势下降,植物免疫水平受影响。然而,钙元素对柑橘溃疡病抗性的影响尚不明确。【目的】分析对柑橘溃疡病敏感的枳（Poncirus trifoliata）在不同钙浓度处理下叶片注射接种Xcc后的致病差异,探讨钙在Xcc侵染枳叶片过程中的作用。【方法】采用沙培法对枳实生苗进行0、0.75、3、30 mmol·L^-1钙浓度处理,分别测定枳生长期的生物量、叶绿素a和b浓度、根系和叶片钙元素含量、观察根系活性氧（ROS）的产生和胼胝质沉积,并分析枳叶片接种Xcc后细胞壁合成相关基因及免疫途径相关基因诱导表达变化特征。【结果】以3 mmol·L^-1钙处理为对照,0、0.75和30 mmol·L^-1钙处理后,枳地上部和地下部生长发育均受抑制,叶绿素a和b浓度降低;根系与叶片中的钙含量与外源钙施加量成正比;不同钙浓度处理后根系中产生ROS和胼胝质沉积,在3 mmol·L^-1处理时达到最大值;枳叶片接种Xcc后,随着钙浓度增加,叶片症状逐渐减轻,但Xcc的生长量无明显差异;相较于3 mmol·L^-1处理,参与细胞壁合成相关基因PtCESA4在0 mmol·L^-1处理下受Xcc诱导先上调表达后下调表达,在30 mmol·L^-1处理下受Xcc诱导上调表达,PtPME和PtFLA在0 mmol·L^-1处理下受Xcc诱导下调表达,在30 mmol·L^-1处理下受Xcc诱导上调表达;叶片接种Xcc 0、2、4、6 dpi后免疫途径相关基因PtGSL、PtGST1、PtWRKY22在30 mmol·L^-1处理下受Xcc诱导表达水平高于0 和3 mmol·L^-1处理。【结论】钙缺乏和过量均会影响枳生长发育,引起叶片失绿,根系产生ROS和胼胝质沉积均有所减少。施钙后接种Xcc,叶片表面的感病症状明显减弱,但菌含量与对照无显著差异。钙可能通过调控细胞壁合成相关基因促使细胞壁增厚,从而抑制Xcc突破叶片表皮形成典型症状。     

基于基因组序列分析的烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物侵染性克隆构建

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一,严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性,为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样,提取总RNA,利用TMGMV特异检测引物确认阳性后,设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列,通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上,获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性,利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒,经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果,测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt,编码4个功能蛋白,分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白C...     

马蜂柑响应黄龙病菌不同侵染时期的生物学和转录组学分析

【目的】 柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑（Citrus hystrix）在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。 【方法】 以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月（最早检测到CLas阳性）作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。 【结果】 症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1 384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。 【结论】 马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀粉合成和光合作用等途径不受干扰;而水杨酸介导的抗性信号转导、效应蛋白触发免疫反应（effector-triggered immunity,ETI）激活的病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶参与的解毒作用是感病后期的主要耐病机制。     

基于转录组SNP构建油茶主要品种资源的分子身份证

【目的】近年来,油茶（Camellia oleifera）产业发展迅速,已成为中国四大油料之一。油茶良种不断涌现,但品质参差不齐,“同名异物、同物异名”等现象时有发生。建立油茶品种资源的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism,SNP）分子标记数据库,筛选重要SNP位点,开发油茶品种资源DNA指纹图谱,构建油茶品种资源的分子身份证,为品种鉴别、品种追溯等提供分子水平鉴别技术支撑。【方法】以221份普通油茶品种资源为材料,提取未成熟种子RNA,进行转录组测序。以二倍体南荣油茶基因组为参考,识别供试油茶品种资源的SNP位点并基因分型,利用SNP数据分析油茶群体及亚群的遗传多样性,分析SNP位点的观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量（PIC）等信息,筛选核心SNP位点并采用Sanger测序验证,得到最优SNP位点组合后,结合品种资源基本信息构建油茶品种资源分子身份证。【结果】从油茶转录组中共检测到1 849 953个高质量SNP位点。群体遗传多样性分析发现,油茶群体观测杂合度为0.2966,期望杂合度为0.2462,固定指数为-0.2048,PIC为0.2...     

基于柑橘叶斑驳病毒的表达载体构建及应用

【目的】 构建基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】 基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）基因（gfp）,通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽（cecropin B,CB）基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】 pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组（pCLBV202-CB）较对照组（pCLBV202）发病时间延迟4 d。在接种后第24天（24 dpi）,处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】 构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。     

榅桲4CL基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆榅桲果肉(Cydonia oblonga Mill)中4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)基因,研究其序列特征,为该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果肉为试材,基于GenBank报道的近缘物种4CL基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出4CL基因片段并克隆到pMD18-T载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。【结果】榅桲4CL基因其开放阅读框(ORF)序列为1 710 bp,编码570个氨基酸,蛋白分子质量为68.4 kD,与其他物种序列同源性最高达91.99%,进化关系上与水密桃较近;榅桲4CL蛋白为亲水性蛋白,二级结构中以无规卷曲(Random coil)为主,占比达到44.27%。【结论】获得了榅桲4CL基因全长编码区序列,探明了该序列的结构特征。     

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析

【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH）,分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构...     

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。