新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

苹果茎沟病毒部分分离物的生物学特性与分子鉴定

通过昆诺藜接种鉴定和ELISA检测,从梨和苹果上分离获得苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)23个分离物.采用TC-RT-PCR对这些分离物进行扩增,均获得特异的扩增片段,PCR产物经5%PAGE电泳,出现大小约500、530和600bp的3种迁移率不同的泳动带型.根据PCR产物电泳迁移率的差异,选取3个来源于梨的分离物P-L4、P-6-1-17和P-3-2-67的PCR产物进行克隆与序列测定.经BLAST搜索,3个分离物的扩增片段与苹果分离物P-209的CP基因3′端核苷酸序列同源性分别为92.2%、90.4%和88.4%.3个分离物间的核苷酸序列也有较大差异,P-L4/P-6-1-17为95.5%、P-L4/P-3-2-67为90.4%、P-6-1-17/P-3-2-67为88.6%.     

新疆加工番茄马铃薯Y病毒株系鉴定

 马铃薯Y病毒 (Potato virus Y,PVY) 是世界范围内对茄科属植物造成影响的重要病毒,为了解PVY对新疆加工番茄的危害,本文采集205份加工番茄样品进行血清学检测,结果PVY^O、PVY^O\N\C、PVY^N检出率分别为20%、18.05%和0％,且PVY不同株系总检出率达24.9%。根据血清学检测结果,在苋色藜 (Chenopodium amaranticolor) 上进行单斑分离获得2个PVY分离物S1-10、S2-12,其基因组序列分析结果显示,S1-10分离物是PVY^O与PVY^N的重组体,属于PVY^N∶O株系,S2-12属于PVY^O株系。本研究表明新疆加工番茄上的PVY主要为PVY^N∶O和PVY^O株系。     

辣椒上CMV亚组ⅠB CP基因克隆与原核表达

[目的]克隆辣椒上黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)基因,诱导CP蛋白表达,为下一步制备高效、特异的抗血清奠定基础.[方法]根据已知的新疆石河子辣椒上的CP基因序列设计引物,克隆CMV CP基因,经测序、Noc Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鉴定,成功构建了原核表达载体pET-CMV CP,转化大肠杆菌BL21 DE3,用终浓度为1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达.[结果]成功构建了新疆辣椒上CMV CP原核表达载体pET-CMV CP,获得了与预期大小一致的30 kDa蛋白.[结论]新疆石河子辣椒上CMV CP在原核中获得了正确表达.     

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

[目的]DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用.研究棉花中DELLA基因的功能.[方法]从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型.[结果]序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域.采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47;以上.转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型.[结论]过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育.     

AtEDR1介导拟南芥对稻瘟菌的抗性(英文)

 稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)是一种半腐生病原菌,该病原菌可以侵染水稻,产生稻瘟病。对于水稻与稻瘟菌的互作机制,人们已经进行了大量的研究。然而,鉴于水稻基因组相对较大且稻瘟菌生理小种众多,致使研究进展缓慢。本研究通过将稻瘟菌生理小种Y34侵染拟南芥生态型Col-0,发现Y34可以感染Col-0,从而建立Y34-拟南芥互作模型,用以探究Y34与抗白粉突变体edr1的关系。结果显示,edr1比Col-0对于稻瘟菌更敏感。之前有研究表明,降低SA含量的突变体(pad4,sid2,nim1)均可抑制edr1相关表型。接种Y34于edr1与pad4、sid2、nim1形成的双基因突变体发现,所有双突变体的感病性比edr1单突均明显降低。推测EDR1可能在拟南芥抗稻瘟菌方面起一定正调控作用,且其作用依赖于SA途径的相关基因。     

新疆辣椒中BPEV和PCV2的鉴定与分析

 为明确新疆石河子辣椒感染病毒的种类,对表现明显皱缩、褪绿和卷叶等症状的辣椒样本进行长链非编码RNA(Long noncoding RNA, LncRNA)测序。根据LncRNA测序和RT-PCR检测,发现甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus, BPEV)、辣椒隐症病毒2(Pepper cryptic virus 2, PCV2)和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)3种病毒。RT-PCR检测数据显示,新疆石河子的辣椒普遍感染BPEV和PMMoV。将BPEV的RdRp基因序列和PCV2-RNA1包含RdRp基因的序列分别进行核苷酸序列相似性和系统进化分析。结果表明本研究中BPEV-XJ和PCV2-XJ与其它分离物的相似性分别为89.1%~97.3%和96.9%~99.7%。BPEV-XJ与BPEV-TW分离物亲缘关系最近;PCV2-XJ与PCV2-DR分离物亲缘关系最近。辣椒中检测到BPEV和PCV2为新疆首次报道。     

CMV 2b和ToMV CP酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活效应检测

通过RT-PCR从CMV和ToMV新疆分离物中扩增出CMV 2b和ToMVCP这2个基因,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用和对酵母细胞温敏特性影响。结果表明,这2个诱饵载体构建成功,对酵母菌株cdc25H无毒性和对Sos恢复系统无激活作用。为利用酵母双杂交系统研究加工番茄病毒的感染机制和病毒-寄主相互作用及防治加工番茄病毒病奠定了基础。     

新疆番茄病毒病检测及南方番茄病毒全基因组序列测定与传播特性分析

为了解新疆番茄上病毒病的发生情况,利用一步法RT-PCR技术检测了南北疆番茄上南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)以及马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的感染情况,并利用分段克隆的方法进行全基因组测序,通过RT-PCR方法检测健康植株与携带病毒植株杂交育种的F1代植株带毒率以分析STV的种子传播特性。结果显示,新疆番茄上CMV、STV、ToMV和PVY在北疆的检出率分别为52%、37%、27%和14%;在南疆的检出率分别为79%、60%、69%和0;且以STV、CMV及ToMV的复合侵染为主。从我国加工番茄上首次获得了长3 437 nt的STV SHZ-1核苷酸序列,序列比对分析发现其与已报道STV只有1~9个核苷酸的变异,且序列变异与地域无相关性。分析杂交F1代加工番茄植株上STV的传播特性,发现其除可由种子传播外,也可通过花粉传播。表明STV是侵染新疆番茄的主要病毒之一,且该病毒可通过种子或杂交育种途径进行传播。     

新疆石河子、伊宁地区黄瓜花叶病毒株系分化

为了研究新疆黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分子变异及株系分化,对从石河子和伊宁地区采集的205个加工番茄、23个辣椒、4个番茄、2个南瓜样品进行酶联免疫检测和RT-PCR检测.在4种寄主上均检出了亚组Ⅰ型CMV,其中加工番茄的感染率高达74.15％.进一步对来自辣椒的YN-6、LJ-4、L-10,加工番茄的S1-1、S1-14,番茄的YN-2,以及南瓜的YN-9等7个样品CP、RNA3、MP核苷酸序列进行相似性和进化树分析.7个样品与CMV亚组ⅠB株系分离物的相似性较高、亲缘关系最近,均可归为CMV亚组ⅠB.而来自辣椒的LJ-4、L-10与其余5个样品的序列相似性较低,亲缘关系较远,在进化树上形成独立分支.说明在新疆加工番茄及其它蔬菜上广泛流行的CMV存在分子变异.