巴西橡胶树ADF6基因的克隆与表达分析

肌动蛋白解聚因子(Actin Depolymerizing Factor,ADF)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白。ADF通过参与调控肌动蛋白的装配和解聚在多种生理过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR技术从橡胶树胶乳中获得HbADF6基因的cDNA和基因组序列,序列分析显示HbADF6基因的开放阅读框为441 bp,共编码146个氨基酸,基因组序列由2个内含子和3个外显子组成。实时荧光定量PCR结果表明,HbADF6基因在所有检测组织中均表达,其中树皮中表达量最高,叶片中表达量最低。HbADF6基因的表达受乙烯利(ET)和碘化钾(KI)调控,并与排胶时间和死皮有关。此结果表明HbADF6基因可能在橡胶树乙烯响应、死皮和排胶过程中发挥重要作用。      

橡胶树胶乳HbPLDα1基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸（Jasmonic acid, JA）生物合成的关键酶之一。橡胶树胶乳PLDα1基因（HbPLDα1）表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制。在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列。HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2 427 bp的完整开放阅读框（ORF）,具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近。HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用。     

巴西橡胶树橡胶粒子中2个含RicinB_Lectin_2结构域蛋白质研究初报

采用不同提取液,从洗涤过的巴西橡胶树橡胶粒子中提取蛋白质,并对其进行电泳分离与质谱鉴定。分离鉴定了2个含RicinB_Lectin_2结构域的糖基识别蛋白质,分别命名为HbRBLLP-1和HbRBLLP-2。这2个蛋白质可能是橡胶粒子膜蛋白质或是与橡胶粒子有较强的相互作用的蛋白质。对HbRBLLP-1及HbRBLLP-2进行生物信息学分析,结果表明它们的RicinB_Lectin_2结构域均仅有1个Q-x-W模体,而非蓖麻毒素B链所具有的(Q-x-W)3模体。     

橡胶树排胶机理与调控研究进展

排胶是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）树皮乳管细胞中胶乳采收的重要环节,与天然橡胶的生物合成、胶乳再生、割胶技术、韧皮部膨压等众多因素相关,占生产成本的60%以上。近年来,天然橡胶异戊二烯途径合成与调控机制、胶乳诊断指标、乳管伤口堵塞和过度排胶导致的死皮发生和修复机理等领域均取得了重要进展。本文从天然橡胶生物合成和胶乳再生、乳管伤口堵塞、排胶影响因素、排胶生理与分子机理4个方面总结了排胶领域的研究现状,并结合新技术持续引入排胶研究领域的最新进展,展望了橡胶树排胶机理研究发展趋势和应用,为橡胶树排胶机制研究提供理论依据,亦为新型高效安全刺激技术研发提供指导。     

橡胶树甾醇14α-去甲基化酶基因(HbCYP51)的克隆及机械损伤和外源激素对其表达的影响

甾醇14α-去甲基化酶(sterol 14α-demethylase,CYP51)是细胞色素P450家族的重要成员之一。基于从巴西橡胶(Hevea brasiliensis)胶乳转录组文库分离出的目的基因,利用实时荧光定量PCR方法研究橡胶树在不同机械损伤(割次)中和外施乙烯利和茉莉酸后,其胶乳中Hb CYP51 m RNA表达差异,探讨不同刺激方式和水平对Hb CYP51基因表达的影响。BLAST结果表明,本研究克隆了1个与细胞色素P450相关的基因,该基因与毛果杨(Populus trichocarpa)(90%)和苹果(Malus domestica)(88%)中已报道的CYP51同源性最高,命名为Hb CYP51(Gen Bank登录号:KM203677),含有3个外显子和2个内含子,其c DNA全长2 305 bp,包括1 461 bp的开放阅读框(ORF),推测编码1个含486个氨基酸的蛋白。定量RT-PCR分析表明,胶乳Hb CYP51基因是诱导型表达,并被割胶、乙烯利和茉莉酸调控表达,其中受24 h茉莉酸诱导上调表达最显著(P0.01),首次证明了割胶、乙烯利和茉莉酸可激活Hb CYP51的表达。相关性分析表明,割胶刀次与Hb CYP51基因的表达量和胶乳产量均呈极显著正相关(P0.01),而胶乳产量与Hb CYP51基因的表达量无显著相关。研究结果初步说明,Hb CYP51可能是巴西橡胶的重要防御因子,直接或间接参与对割胶和乙烯利的防御反应。     

巴西橡胶树橡胶粒子蛋白质的16-BAC/SDS-PAGE双向电泳及质谱分析

【目的】分析巴西橡胶树（Hevea Brasiliensis Müll.Arg.）橡胶粒子的蛋白质构成,探索未知的橡胶粒子蛋白质。【方法】采用16-BAC/SDS PAGE双向电泳分离橡胶粒子蛋白质,采用MALDI/TOF-TOF质谱技术进行蛋白质鉴定;此外,利用磺基异硫氰酸苯酯（SPITC）化学辅助质谱测序法进行肽段的从头测序,获得未知蛋白质肽段的氨基酸序列。通过搜索橡胶树胶乳转录组测序获得的EST数据库,获取已知部分氨基酸序列蛋白质的全序列,或通过部分肽段获取为未知蛋白质编码的EST序列。【结果】获得了橡胶粒子蛋白质的16-BAC/SDS-PAGE双向电泳图谱,鉴定了17个橡胶粒子蛋白质;获得1个小橡胶粒子蛋白（small rubber particle protein,SRPP）亚家族成员SRPP(gi|37622210)的完整氨基酸序列以及1个橡胶延伸因子（rubber elongation factor,REF）亚家族新成员(hbREF2)的C端87个氨基酸残基序列,此蛋白质的氨基酸序列与已知的REF(gi|38122474)具有高度的相似性。【结论】采用16-BAC/SDS-PAGE双向电泳有效地分离了橡胶粒子蛋白质,展现了橡胶粒子蛋白质的相对含量,研究结果表明构成橡胶粒子的主要蛋白质组分是REF和SRPP亚家族蛋白质。橡胶粒子的蛋白质组分的全面鉴定,将有助于揭示橡胶粒子的生物学功能。     

巴西橡胶树脱水素基因HbDHN2的克隆及其氨基酸序列分析

脱水素(dehydrin,DHN)是存在于植物体内高度亲水的一类蛋白质,在植物响应和适应干旱、低温和盐渍等非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究在橡胶树已有转录组测序组装序列(TSA)数据的基础上,通过RT-PCR方法克隆了一个新巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)脱水素基因HbDHN2,并分析其氨基酸序列。结果表明,HbDHN2含210个氨基酸残基,与HbDHN1同为SK2型酸性脱水素,属于优先响应低温胁迫的脱水素类型(SKn)。     

应用高效液相色谱技术建立检测巴西橡胶树叶片和枝条中4种植物激素的方法

以2002年定植于中国热带农业科学院试验场三队的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)热研73397的枝条和叶片为研究对象,采用安捷伦1260II高效液相色谱仪测定叶片和枝条中的生长素、玉米素、赤霉素、脱落酸,分析高效液相色谱(HPLC)技术在植物激素检测中的应用,优化植物激素提取方法,建立了一种同时检测巴西橡胶树叶片和枝条中生长素、玉米素、赤霉素、脱落酸的检测方法.结果表明:4种激素洗脱的先后顺序为玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸,洗脱时间分别在2.166、3.871、8.133、13.405 min.橡胶树叶片和枝条中4种植物激素的检测限低至0.5μg·L-1,加标回收率在85.63％～105.13％.建立的检测方法,可简便、快捷检测橡胶树叶片和枝条等部位的植物激素,精确定量反应橡胶树排胶前后过程中的激素信号.     

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

巴西橡胶树橡胶粒子中2个含RicinB_Lectin_2结构域蛋白质研究初报

采用不同提取液,从洗涤过的巴西橡胶树橡胶粒子中提取蛋白质,并对其进行电泳分离与质谱鉴定。分离鉴定了2个含RicinB_Lectin_2结构域的糖基识别蛋白质,分别命名为HbRBLLP-1和HbRBLLP-2。这2个蛋白质可能是橡胶粒子膜蛋白质或是与橡胶粒子有较强的相互作用的蛋白质。对HbRBLLP-1及HbRBLLP-2进行生物信息学分析,结果表明它们的RicinB_Lectin_2结构域均仅有1个Q-x-W模体,而非蓖麻毒素B链所具有的(Q-x-W)3模体。