橡胶树前纤维蛋白（profilin）基因家族的鉴定及表达分析

肌动蛋白细胞骨架可能在橡胶树乳管伤口堵塞过程中发挥重要作用。前纤维蛋白（profilin）是肌动蛋白动态平衡的重要调节子,但对橡胶树profilin基因家族系统研究的报道较少。通过分析橡胶树基因组和转录组数据,鉴定到6个橡胶树profilin基因,对其基本特性及蛋白保守基序、结构特征、进化关系和表达模式等进行分析。基因结构分析表明,橡胶树profilin基因都包含3个外显子2个内含子,编码的蛋白序列含有profilin蛋白特有的保守基序KYMVIQGE和VIRGKKG。进化分析显示,橡胶树profilin并未严格分为营养型和生殖型2种类型。profilin蛋白二级结构以无规则卷曲为主,三级结构均包含3个α螺旋和7个β折叠。表达分析结果显示,4个profilin基因在胶乳中高表达,橡胶树排胶和碘化钾处理调控这4个profilin基因表达,推测profilin基因参与橡胶树排胶过程。该研究结果为进一步阐明橡胶树profilin基因在乳管伤口堵塞和排胶中的作用奠定基础。     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC1     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因（HbACO7）的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

橡胶树产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中表达模式分析

橡胶树死皮(Tapping Panel Dryness,TPD)是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给中国橡胶种植业带来巨大经济损失。本文利用RT-PCR技术分析14个产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中表达模式。研究结果表明,有8个基因在健康橡胶树树皮中上调表达,其分别是法尼基焦磷酸合酶、小橡胶粒子蛋白、橡胶素、蔗糖转运蛋白5、橡胶延伸因子、几丁质酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合成酶,有4个基因在死皮橡胶树树皮中上调表达,他们分别是橡胶转移酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶、蔗糖转运蛋白2a和β-1,3-葡聚糖酶;另外,蔗糖转运蛋白2b和蔗糖转运蛋白1表达模式没有发生变化。此结果为深入揭示橡胶树死皮发生分子机制提供新观点。     

巴西橡胶树中谷胱甘肽及其合成代谢途径关键酶活性的研究

硫醇广泛存在于巴西橡胶树胶乳中，其主要成分为还原型谷胱甘肽(GSH)，在橡胶树产排胶和死皮中发挥重要作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是催化GSH生物合成的限速酶，谷胱甘肽还原酶(GR)在NADPH作用下催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原为还原型GSH。GSH的抗氧化能力很大程度上取决于其在胞内的浓度及GSH/GSSG的比率。本研究发现健康橡胶树胶乳中的硫醇含量、γGCS和GR活性高于死皮树。H2O2能增加PR107、RY7-33-97和RRIM600 3个品系橡胶树幼苗叶片中GSH/GSSG比例、γGCS和GR活性，其中RRIM600上调最为明显，PR107变化最小。研究结果为进一步揭示硫醇在产排胶和死皮中的作用提供了实验证据，同时也为阐明橡胶树活性氧与死皮的关系奠定了基础。     

橡胶树胶乳几丁质酶基因表达的品种差异

为了探讨不同品系橡胶树胶乳中几丁质酶基因在表达水平上的差异,利用聚合酶链式反应(PCR)技术,克隆得到长为935bp的橡胶树几丁质酶基因,对其进行序列测定。结果表明,该基因序列与EvertBokma(2001)发表的橡胶树几丁质酶基因序列一致。此外,从3个不同品系橡胶树胶乳中提取总RNA,以已克隆的基因为探针进行Northern狭线杂交。结果表明:3个不同排胶特性品系PR107,GT1,RRIM600的几丁质酶基因杂交信号强度表现为PR107GT1>RRIM600。     

巴西橡胶树铁硫簇支架蛋白cDNA的克隆与分析

"死皮"是指橡胶树(Hevea brasiliensis)产排胶过程中出现的一种割线症状,主要表现为割线局部或全部不排胶。为揭示"死皮"发生的分子机理,本课题组构建了死皮植株与健康植株的差减文库,从中筛选到一条在死皮植株中下调表达的基因片段,其编码的蛋白与铁硫簇支架蛋白的相似性非常高。为深入研究ISU在橡胶树"死皮"中的生物学功能,本研究对其cDNA序列进行了克隆和分析。通过ESTs序列拼接和RT-PCR,获得一条532 bp的cDNA序列(命名为HbISU1,GenBank登陆号为HM640242),该序列包含一完整的开放读码框,编码166个氨基酸,理论分子量为17.92 ku,等电点为8.99。同源序列比对表明,铁硫簇支架蛋白在不同生物中非常保守,HbISU1与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中相关蛋白的相似性都在75%以上,与大肠杆菌(Escherichia coli)ISCU的相似性也超过50%。HbISU1含有一个IscU和NifU类蛋白所特有的保守结构域,线粒体定位,无跨膜结构域,可能是一个线粒体基质蛋白。     

橡胶树HbRAN1基因的克隆与表达分析

利用本课题组获得的二代测序(FLX454)转录组数据库,筛选并克隆获得到1条969 bp的核苷酸序列,该序列编码1个由221个氨基酸组成的25.11 ku蛋白,氨基酸同源性分析发现,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白RAN亚家族,且与蓖麻、烟草、水稻、小麦等的RA N1基因序列高度同源,命名为HbRA N1(GenBank登录号:KC577150).实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因受割胶、伤害、高温、低温、干旱及乙烯利等因素调控,同时其表达模式与橡胶树死皮程度相关,但对SA、GA、JA、ABA、CTK、2,4-D等激素处理应答不明显.结果表明,HbRA N1基因编码1个典型的RAN蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因.     

巴西橡胶树乳管肌动蛋白细胞骨架与采胶的关系

以成龄巴西橡胶树为材料，用免疫印迹技术研究了胶乳中的肌动蛋白，并用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光探针检查了乳管伤口的肌动蛋白细胞骨架。割胶后收集的胶乳，经超速离心分离的各个组分中，C乳清(胞质溶液)组分含有肌动蛋白。排胶初始期流出的胶乳中肌动蛋白含量多，排胶后期流出的胶乳中肌动蛋白的含量减少。比较了不同割胶强度下收集的胶乳中肌动蛋白的含量，结果表明在强度割胶条件下，胶乳中的肌动蛋白含量较少。用显示肌动蛋白微丝的鬼笔环肽荧光探针检测到，停止排胶时的乳管伤口末端有一团呈现橙红色的荧光物质，表明了肌动蛋白微丝在伤口末端聚积。进行了外施肌动蛋白微丝的解聚剂大环内脂和碘化钾刺激采胶试验，结果表明：施用质量分数1％的碘化钾和饱和浓度的大环内酯水溶液能使胶乳产量增加。这些事实表明，肌动蛋白细胞骨架可能在橡胶树乳管排胶和乳管堵塞中起重要作用。     

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。     

新型排胶调节剂对橡胶树无性系热研8-79的增产效应

以橡胶树无性系热研8-79为材料,分析一种新型排胶调节剂对胶乳产量、干胶产量、茎围增长、树皮结构和死皮发生的影响。结果表明：新型排胶调节剂在高温季节有明显的增产效应,胶乳产量和干胶产量分别增长23.38％和16.01％;新型排胶调节剂能有效降低死皮发生率,仅为2.22％,而且能促进乳管分化,对茎围增长没有明显的抑制效应。结果说明新型排胶调节剂具有高效性和安全性。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。     

西双版纳橡胶树死皮病症状调查

调查西双版纳RRIM600和GT1两个品种橡胶树的不同割龄段死皮树的症状,根据排胶、割线颜色、树体状况三个方面的症状表现,死皮病典型症状可归纳为点状排胶或割线干涸,割线褐色、暴皮三种表现,其中RRIM600死皮树表现割线干涸和点状排胶的分别为41.7%和45.3%,割线表现内褐、褐皮平均分别为42.7%和35.2%,树体多数表现为块状暴皮,平均达44.8% GT1死皮树症状以割线干涸为主,占61.9%,其次为点状排胶,占23.9%,割线表现为褐皮、内褐的分别占29.5%和44.9%,树体多数表现为短裂纹状暴皮,平均达34.1%。文章还对死皮病病程、诱因进行探讨。     

橡胶树排胶机理与调控研究进展

排胶是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)树皮乳管细胞中胶乳采收的重要环节,与天然橡胶的生物合成、胶乳再生、割胶技术、韧皮部膨压等众多因素相关,占生产成本的60％以上.近年来,天然橡胶异戊二烯途径合成与调控机制、胶乳诊断指标、乳管伤口堵塞和过度排胶导致的死皮发生和修复机理等领域均取得...     

巴西橡胶树SnRK1家族基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶I(Sn RK1)是植物糖信号途径的关键因子,广泛参与植物生长发育。以蓖麻Sn RK1基因序列为探针,采用同源克隆的方法获得了橡胶树Sn RK1家族2个基因的全长c DNA,分别命名为Hb Sn RK1-1(KX237690.1)和Hb Sn RK1-2(KX237691.1)。2个Hb Sn RK1基因均编码含515个氨基酸且序列高度一致(96.5%)的蛋白质;2个基因均含10个外显子、9个内含子,且外显子大小相近,但基因长度差异明显。在6种橡胶树组织中,2个Hb Sn RK1基因均有表达,但Hb Sn RK1-1在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达量明显高于Hb Sn RK1-2;在叶片发育不同时期,Hb Sn RK1-1的表达变化不显著,而Hb Sn RK1-2的表达随叶片发育明显下降;在胶乳中,Hb Sn RK1-1的表达显著受乙烯和茉莉酸诱导、受2,4-D抑制,但Hb Sn RK1-2表达受激素处理的影响较小,推测Hb Sn RK1可能参与胶乳再生的激素调控。