霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库构建

[目的]构建霜霉菌侵染后葡萄叶片的酵母双杂交cDNA文库,筛选致病因子在寄主葡萄体内的互作靶标,为葡萄霜霉病菌致病的分子机理研究提供材料基础.[方法]以一年生欧亚种葡萄西拉盆栽苗为试验材料,提取并等量混合霜霉菌侵染后0、12、18、24和36 h的葡萄叶片总RNA,利用基于Gateway技术的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒:首先将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应连接,连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建初级文库;然后初级文库质粒与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应,重组反应产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建次级文库;再随机挑取次级文库转化Y187酵母菌株构建酵母双杂交cDNA文库;最后利用ImageJ软件和PCR反应分别统计库容量和鉴定重组率.[结果]构建的初级文库库容量为4.6×107 CFU,次级文库库容量为2.7×107 CFU,均达到构建cDNA文库的标准.酵母双杂交cDNA文库的插入片段主要集中在1000~2000 bp,且具有很好的多态性,文库质量较高.[结论]构建的霜霉菌诱导葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库符合酵母双杂交筛选要求,可用于筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标及霜霉菌侵染寄主葡萄早期抑制寄主免疫过程中的致病机理研究.     

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因家族的生物信息学分析

【目的】分析预测葡萄霜霉菌糖基水解酶（Glycoside hydrolases,GHs）基因家族,为深入研究GHs基因在葡萄霜霉菌致病过程中的作用机理提供理论依据。【方法】利用SignalP 5.0 Server、Cluster W、MEGA 6.0和MEME等生物信息学相关软件对已发表的葡萄霜霉菌全基因组60个GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码蛋白保守基序、结构域和亚细胞定位等进行生物信息学分析。【结果】葡萄霜霉菌60个GHs基因编码的蛋白长度在128~774 aa,且大部分集中在200~500 aa,其中53个蛋白具有信号肽,蛋白质分子量在14.90~85.45 kD,理论等电点（pI）在3.85~10.39;这些基因在基因组中分布不均匀,其中有27个GHs基因存在串联重复和成簇聚集分布现象,数目最多的3个GHs家族（GH131、GH17和GH6）集中分布在7个scaffold中;序列比对和系统发育进化树分析发现,串联重复和成簇聚集分布的GHs基因处于同一个分支中;motif富集分析发现3个不同的motif,且motif2在葡萄霜霉菌GH6、GH17和GH131等3个家族基因中保守,结构域分析推测大部分GHs家族基因均参与细胞壁的生物过程;亚细胞定位预测结果表明,有53个GHs蛋白定位于细胞外,3个定位在细胞质内,4个定位于线粒体上。【结论】葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构,以帮助其在寄主植物中成功定殖。     

关于客户经理责任制和项目经理责任制的比较分析

客户经理责任制和项目经理责任制是两种不同的业务经营模式,这两种模式有什么不同?适合于什么样的经营环境?需要什么样的配套条件,等等,下面试作初步比较分析。一、两种制度的基本内容1.客户经理责任制,顾名思义,是以客户为中心的业务经营模式,它要求经理人员应当以客户需求为导向,为其提供尽可能好的专业服务(包括已有的和可能通过创新实现的),以维持与客户的长期关系和业务量,实现本单位长期价值的最大化,提高市场竞争力。2.项目经理责任制是以项目为中心的业务经营模式,它要求经理人员对项目承担明确的责任.同时赋予经理人员以较大的自主权,以提高项目运行质量和效率,力争实现项目价值最大化,提高本单位市场竞争力。     

葡萄miR169及其靶基因的生物信息学分析

[目的]明确葡萄miR169(vvi-miR169)基因家族在葡萄生长发育及逆境胁迫响应中的重要作用,为其在葡萄分子育种和抗逆新品种选育中的应用提供参考依据.[方法]利用miRNA、Phytozome、NCBI等数据库及ClustalX 2.1、MEGA 6.0、RNAfold WebServer、psRNATarget等在线软件对vvi-miR169基因家族的序列分布、定位特征、二级结构、发育进化树和靶基因调控功能进行生物信息学分析.[结果]在miRBase中搜索到25条vvi-miR169基因同源序列,分别分布在6条染色体上,其中以位于Chr11上的序列最多,共有17条,位于Chr01、Chr04和Chr14上各有2条,而在Chr08和Chr17上各有1条.vvi-miR169基因家族成熟序列的碱基保守性很高,其前体序列均可形成稳定的二级茎环结构,且位于同一条染色体上的miR169基因序列显示出相对更近的亲缘关系.vvi-miR169基因家族共预测到21个靶基因,绝大部分miRNA都有多个靶基因,且不同miRNA具有相同的靶基因,其中有22个miRNA靶基因均含有GSVIVT01015120001(NF-YA转录因子).[结论]vvi-miR169基因家族序列保守性较高,家族特征明显,且具有相似的调控功能;NF-YA转录因子是vvi-miR169基因家族最主要的靶基因,也是葡萄生长发育过程中抗逆境胁迫的主要调控元件.     

基于高通量测序的野生毛葡萄转录组数据分析

利用RNA-seq技术对所构建的野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)叶片的转录组进行测定,对原始reads进行过滤和组装,得到了35 238条质量较高的unigene,平均长度为1 081 nt,N50为1 735 nt。基于NCBI蛋白质数据库(Nr)、蛋白质序列数据库(Swiss-Prot)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库和直系同源基因簇(COG)进行相似性比对,共注释了26 751条unigene,另有8 487条unigene未被注释。物种同源性显示与葡萄的同源性最高为74.48%。利用COG数据库将unigene分成25类,通过GO分类和KEGG富集性分析,将unigene分别归类于44个GO类别和122个代谢途径。此外,在35 238条unigene中共搜索到4 428个SSR位点,二核苷酸的SSR数目最多(1 906条),其次为三核苷酸(1 762条)。这些信息为毛葡萄功能基因、相关候选基因的发掘以及分子标记辅助育种提供了重要依据。     

6个葡萄品种一年两收技术的研究

葡萄一年两收技术不仅能增加葡萄产量,还能通过延长葡萄的销售期,错过采摘过于集中的时期从而提高售价。本试验采用夏果采收后利用破眠技术使休眠芽在当年夏季又萌芽开花结冬果的一年两收技术,对6个鲜食葡萄品种进行了连续两年的二茬果试验,从采后药剂处理、药剂+叶面肥处理、修剪节位等3个方面开展研究,初步掌握了无核早红、红标无核、金手指、黑峰、贵妃玫瑰和温克在广西南宁地区的一年两收技术。     

一年两收技术在不同葡萄品种上的应用表现

葡萄一年两收技术不仅能增加葡萄产量，还能通过延长葡萄的销售期，使其错过采摘过于集中的时期从而提高销售价。本实验采用夏果采收后利用破眠技术使休眠芽在当年夏季又萌芽开花结冬果的一年两收技术，对6个鲜食葡萄品种进行了连续两年的二茬果实验，从采后药剂处理、药剂加叶面肥处理、修剪节位等三个方面开展研究，初步掌握了无核早红、红标无核、金手指、黑峰、贵妃玫瑰和温克在广西南宁地区的一年两收技术。     

查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用

[目的]克隆不同抗性葡萄品种中查尔酮合成酶(chalcone synthase)基因CHS1,明确该基因在葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)侵染下的表达模式,并对CHS1进行亚细胞定位和功能验证,为探究CHS1的广谱抗病作用机理提供依据.[方法]分别...     

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析

【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH）,分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构...     

葡萄MrRPV1蛋白LRR结构域的功能研究

[目的]明确葡萄霜霉病抗性蛋白(MrRPV1)LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响,为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础.[方法]将MrRPV1和白粉病抗性蛋白(MrRUN1)两个蛋白的LRR结构域互换,构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株,并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定.[结果]共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因(重组了MrRPV1蛋白LRR结构域)株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因(重组了MrRUN蛋白LRR结构域)株系.在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中,仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点,肉眼观察不到白色霜霉状物,但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性.在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中,RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性,有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死(PCD);RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病.[结论]MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别,而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别.