甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价

为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。     

低温胁迫下山葡萄叶片酵母cDNA文库构建

【目的】葡萄栽培过程中,由低温造成的冷害或冻害严重影响葡萄的生长发育、果实品质和产量。山葡萄是葡萄抗寒育种的重要种质资源,本文通过构建低温胁迫下山葡萄叶片酵母cDNA文库,为葡萄抗寒分子机理研究提供物质基础。【方法】以抗寒山葡萄左山-1(V. amuerensis cv.Zuoshan-1)扦插盆栽苗为材料,提取4℃低温处理0、2、4、8、12、24 h后叶片总RNA,采用SMART技术反转录为cDNA,经纯化和短片段去除后克隆至pGADT7三框质粒载体上,经过纯化后获得初级cDNA文库,对初级文库进行扩增、提取文库质粒后转入酵母Y187菌株中,制作扩增的酵母文库,并对文库质量进行鉴定。【结果】经检测所构建的3个读码框初级文库库容分别为1.7×10⁶、2.0×10⁶和1.9×10⁶ cfu,重组率为100%,插入的片段长度主要分布在500～2 000 bp;电泳检测和测序结果表明,插入片段所对应的编码蛋白类型丰富,具有良好的多态性。最终获得的Y187酵母文库滴度为4.0×10⁸ cfu·mL     

巴西橡胶树胶乳酵母双杂交cDNA表达文库的构建及分析

提取巴西橡胶树胶乳总RNA,并纯化mRNA.采用特异引物（oligo-dT）反转出第一链DNA,经LDPCR合成第二链DNA.将ds cDNA和经Sma Ⅰ线性化的pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母菌,构建酵母双杂交cDNA表达文库.结果表明,转化单菌落个数为2.8 ×107;文库滴度为4.92×107·mL-1;插入片段大小主要分布于500 ～2 000 bp间;重组率为96％.实验数据表明该文库能满足后续的杂交筛选.     

喉癌细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

目的构建喉癌(Hep-2)细胞的酵母双杂交cDNA文库,为筛选包涵体膜蛋白分子的作用配体提供前期工作基础.方法从Hep-2细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Hep-2细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.结果所构建的文库展现出良好的多态性.结论可用于酵母双杂交系统的筛选.     

猪脂肪组织酵母双杂交文库的构建及质量鉴定

为了研究猪脂肪细胞分化的蛋白质之间的相互作用,采用LR重组反应的方法,构建猪脂肪组织酵母双杂交文库。结果显示,酵母双杂交文库的库容量为5.28×106CFU。随机挑取的24个克隆均带有插入片段,重组率100%,片段大小多数为1~2 kb,表明构建的文库质量较高。     

稻曲病菌侵染水稻颖花的酵母双杂交cDNA文库构建与应用

【目的】近年来稻曲病日益严重,但目前对稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)与水稻相互作用机制仍不清楚。论文旨在利用水稻感病颖花材料构建酵母双杂交文库并筛选稻曲病菌效应因子互作蛋白,为解析稻曲病菌侵染水稻机制提供理论基础。【方法】以感病水稻Chuannong H2S为试验材料,在水稻破口前5—7 d左右,从水稻穗中上部接种PSB摇培7 d的稻曲病菌荧光标记菌株P4,接种13 d后取颖花进行激光共聚焦观察,收集感病颖花。提取感病颖花总RNA,使用含有Oligo(dT)的接头引物反转录cDNA第一链,并PCR扩增ds cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收ds cDNA片段,与载体p GADT7-Rec进行同源重组,转化酵母菌株Y187构建酵母双杂交cDNA文库。然后用稻曲病菌效应因子Uv_1261基因构建诱饵载体,将诱饵载体转化入Y2HGold酵母菌株,通过酵母双杂交自激活验证后以该诱饵载体筛选酵母双杂交文库,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选出生长状况良好的蓝色单菌落,经测序得到候选互作蛋白的序列,通过NCBI在线网站进行Blast分析和Uniprot在线网站进行gene ontology(GO)注释。【结果】经检测,文库滴度为5.7×108 cfu/mL,平均插入片段大小为750 bp,表明稻曲病菌侵染水稻颖花cDNA文库质量较高。用Uv_1261构建诱饵载体,转化Y2HGold后,转化菌可在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长,不能在SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A平板上生长,表明Uv_1261无自激活现象。以该诱饵载体筛选文库,对筛选到的候选互作蛋白进行测序验证并Blast分析获得了56个来自稻曲病菌或水稻的候选互作蛋白,其中有28个候选互作蛋白来自稻曲病菌,有16个来自水稻,以及12个未知蛋白。经GO注释显示,来自稻曲病菌中的候选互作蛋白参与了17个生物过程,包括翻译、代谢过程、氧化还原及胞内氨基酸合成等;分子功能包括金属离子结合活性、水解酶活性及ATP结合活性等;细胞组分包括核糖体、细胞质及线粒体等。来自水稻中的候选互作蛋白参与了11个生物过程,包括蛋白质去磷酸化、糖代谢及翻译等;分子功能包括金属离子结合活性、核苷酸结合活性及转移酶活性等;细胞组分包括核糖体、膜及细胞核等。【结论】该cDNA文库质量较好,能成功地用于稻曲病菌效应蛋白的互作蛋白筛选,可为研究稻曲病菌与水稻相互作用的分子机制提供重要资源。     

玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

以玉米骨干自交系478为试验材料,从各生长时期的叶片中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米叶片全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.54×107转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.03×106pfu/mL,重组率为95%。     

番茄斑萎病毒侵染的西花蓟马酵母双杂交cDNA文库的构建和分析

【目的】探明番茄斑萎病毒(Tomatospottedwilttospovirus, TSWV)和介体西花蓟马(Frankliniella occidentalis)之间的分子互作关系,探索介体因子如何参与病毒侵染过程,以期为解析西花蓟马蛋白调控介体传毒机理奠定基础。【方法】通过若虫期饲毒获得高带毒西花蓟马群体,借助SMART技术构建TSWV侵染的西花蓟马酵母双杂交三框cDNA文库。【结果】3种读码框初级cDNA文库的库容量分别为3.0×10⁶、2.0×10⁶和2.0×10⁶cfu,文库实际扩增基数大于1.5×10⁶ cfu(3种读码框均大于5×10⁵)。扩增文库平均插入片段主要分布在0.5～3.0kb。对文库随机挑选16个克隆,测序后与GenBank数据库比对,结果显示各插入片段具有同源序列。【结论】构建的cDNA文库具有较高的库容量和重组率,可用于后续筛选西花蓟马与TSWV互作的蛋白。     

120日龄金华猪骨骼肌酵母双杂交cDNA文库的构建

选用Clontech SMART技术,在酵母菌株中构建猪骨骼肌全长cDNA文库,文库容量约为1.6×106cfu,插入的双链cDNA片段的长度在500～2 250 bp,文库重组比率为93.75%.该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选.     

致病疫霉酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的重要病原菌,在全世界范围内造成了严重的经济损失。以2种不同致病力的致病疫霉菌株侵染马铃薯叶片5个时间点的混合菌丝样品作为cDNA文库的材料来源,利用Gateway法分别构建了初级文库与次级文库,初级文库与次级文库的库容量分别为1.60×10⁷、1.52×10⁷ CFU,插入片段长度大多在1 000～2 000 bp之间,重组率均达到100%。次级文库质粒转化酵母菌构建酵母文库,所得酵母文库滴度为1.00×10⁸ CFU/mL,转化效率为6×10⁸ CFU/μg。结果表明,本研究构建的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完全可以满足互作蛋白高质量、高效率筛选的要求。该文库为后续深入解析致病疫霉的致病机制奠定了基础。     

鸡胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

选取对新城疫病毒(NDV)易感的鸡胚成纤维细胞(CEF),Trizol提取细胞总RNA,用SMART技术合成双链cDNA,然后利用同源重组的方法在酵母细胞内构建CEF的cDNA文库,以寻找与NDV基质(M)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,探讨其相互作用对NDV装配和出芽的影响.结果表明:提取的细胞总RNA的D260nm/D...     

PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

[目的]构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础.[方法]提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(ds cDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处理.处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒.[结果]3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0× 106、2.0× 106和2.0× 106 CFU,文库实际扩增基数>150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%.cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000 bp.cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL,质粒收获量约3.0 mg.[结论]构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制.     

水稻抽穗期基因酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。     

疫霉侵染的辣椒cDNA文库的构建及非特异性脂转移蛋白cDNA的筛选

建立了辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,该原始文库含有1.5×106个独立克隆,插入片段约为0.5-2 kb.采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从该cDNA文库中筛选出了1个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA.经生物信息学分析,推测这个候选基因为非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid-transfer protein,nsLTP)基因.     

桃酵母双杂交cDNA文库的构建及生长素响应因子4互作蛋白的筛选

[目的]为解析桃果实发育成熟的机制,通过构建成熟期前后桃果实的酵母双杂交cDNA文库,筛选生长素响应因子4的互作蛋白,探究生长素响应因子4对桃果实成熟过程的调控作用.[方法]以硬溶质桃(Prunus persica L.)'突围'为材料,提取果皮的总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库,采用Mating法筛选生长素响应因子4的互作蛋白.[结果]构建的酵母双杂交cDNA文库的总库容量1.6×107CFU,重组率100％,插入片段平均长度大于1 000 bp.构建诱饵载体pGADT7-PpARF4重组质粒,在桃果实酵母双杂交cDNA文库中筛选互作的靶蛋白,共获得有潜在互作的蛋白26个,主要功能涉及信号转导与胁迫响应、器官的形成、大分子代谢及蛋白合成与修饰因子.[结论]试验建立的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整性较好,为后续筛选果实成熟相关蛋白奠定基础.     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌(A.tenuissima)cDNA酵母表达文库.经检测,文库的平均滴度为2.44×106 cfu/ml,文库总容量为2.44×107 cfu(colony-forming unit),阳性克隆率为100%,平均插入片段约为1.38 kb.细极链格孢菌cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础.     

草鱼肠道组织差异表达基因消减文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的1龄草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道组织为材料,应用抑制性差减杂交技术,构建了肠道组织的消减cDNA文库.以草鱼管家基因β-actin作为差减指标检测文库差减效率达2~(10)倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到A/T载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.     

霜霉病菌侵染对黄瓜叶片光合作用的影响

研究了温室条件下不同类型黄瓜感染霜霉病后不同发病程度叶片单位叶面积质量、气体交换参数、相对叶绿素含量的变化.结果表明:黄瓜光合系统对霜霉病菌的侵染特别敏感,以欧洲迷你型敏感性较为突出;轻度染病后单位叶面积质量明显下降,净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、相对叶绿素含量明显降低,发病程度越高,降低越明显;非气孔因素可能是感病黄瓜叶片光合降低的主要原因之一.