转TGEV-S基因玉米中目的基因的PCR检测及优化

为提高转基因玉米中目的基因的检出效率,以猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白（TGEV-S）转基因玉米为材料,利用PCR方法检测样品中的目的基因.通过对PCR反应体系中4种不同DNA聚合酶和8种退火温度进行比较,建立和优化了转基因玉米中TGEV-S基因的PCR检测方法.对450株转基因玉米叶片DNA和种子DNA中的TGEV-S基因片段进行检测,并设计33对引物检测插入转基因玉米基因组DNA中的质粒pBAC9020DNA片段.结果显示,LA Taq酶对叶片DNA和种子DNA中TGEV-S片段的PCR扩增敏感性和特异性均优于其他Taq聚合酶,且退火温度为53～55℃时扩增效果较好.分别对450份转基因玉米叶片DNA和种子DNA检测结果显示阳性率分别为82.5％和76.3％.利用33对引物进行的PCR扩增及测序结果显示质粒pBAC9020基因片段已全部插入该玉米基因组DNA中.本试验建立的转TGEV-S基因玉米PCR检测方法敏感性和特异性高,为转基因玉米阳性植株的检测奠定了坚实的基础.     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

牙龈卟啉菌菌毛基因在转基因番茄果实中的特异表达及小鼠免疫实验

将编码牙龈卟啉菌菌毛蛋白（Fimbrillin,FimA）（第266-337Aa）与霍乱毒素B亚基（CTB）基因用农杆菌侵染法转入番茄植株,并利用番茄果实特异启动子E8使其在果实中实现特异表达,然后用特异表达的转基因番茄果实对实验小鼠进行口服免疫实验,研究转基因番茄果实的免疫原性。实验结果表明：获得的11株转化植株中,共有9株重组了CTB-FimA基因的植株在番茄果实中实现了特异表达;口服转基因番茄果实的免疫小鼠的血清中检测到抗FimA抗体;获得了以CTB为佐剂的在番茄果实中特异表达牙龈卟啉菌菌毛基因的植物口服疫苗候选植株。     

核酸免疫制备豇豆胰蛋白酶抑制剂抗体的制备及初步应用

通过构建pcDNA3．1-CpTI真核表达载体，肌肉注射免疫Balb／c纯系小鼠，获得特异性的核酸免疫CpTI抗体，其效价达1：800，所获抗体可与纯化的CpTI蛋白发生特异性反应，检测OD406值和包被蛋白量相关系数为0．9961；间接法测定转cpti基因水稻结果表明，核酸免疫制备的抗体能与转基因水CpTI蛋白产生特异性反应，可用于转基因水稻cpti基因表达的定性测定。     

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达及其免疫原性的研究

 利用番茄果实特异性启动子-E8启动子,将霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)用根癌农杆菌浸润法转入番茄植株,并使其在果实中特异表达,然后对试验小鼠进行口服免疫,研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明,ctb基因在14株番茄植物基因组中被证实有整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达,最高表达量分别为455和385 ng·g-1FW,口服免疫后的小鼠血液和肠道粘膜中均检测到抗CTB抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)的植物口服疫苗候选植株。     

水稻未知功能结构域基因OsDUF6的抗体制备

【目的】制备特异性OsDUF6多克隆抗体,为深入研究OsDUF6在水稻中的生理生化功能提供强有力的工具,为在分子水平上揭示其作用机理奠定基础。【方法】通过对OsDUF6基因进行生物信息学分析,从中选取3段不同区域的氨基酸序列作为抗原,用于抗体制备。用Tetras多通道多肽合成仪合成短肽并用高效液相色谱法(HPLC)进行蛋白质纯度检测;免疫新西兰雄性大白兔,制备相应的多克隆抗体。通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测多克隆抗体效价,通过构建OsDUF6的原核表达载体检测多克隆抗体的特异性,最后利用转基因植株进一步检测抗体。【结果】利用高效液相色谱法(HPLC)检测3条合成的短肽(蛋白纯度85%)用于免疫新西兰雄性大白兔,得到效价为1∶512 000的3种多克隆抗体。构建原核表达载体p GEX6p-1-DUF6,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白GST-OsDUF6,并用GST单克隆抗体成功检测到重组蛋白。在此基础上,对制备的抗体进行特异性检测,结果发现Anti-DUF6-1多克隆抗体结合重组蛋白GST-DUF6的特异性最高。选取该抗体作进一步验证,以非转基因植株作为对照,通过提取DUF6过表达水稻植物总蛋白进行抗体检测,结果表明,Anti-DUF6-1能识别OsDUF6蛋白特异条带,并且在过表达植株中显示较高的蛋白丰度。【结论】制备的Anti-DUF6-1多克隆抗体能特异性识别水稻未知功能域蛋白OsDUF6,可用于该蛋白的进一步功能研究。     

口服重组酵母(ApoB100肽段)对小鼠产生特异性抗体的诱导作用

【目的】开发一种针对低密度脂蛋白成分ApoB100的新型重组酵母疫苗,为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的防治提供一种思路。【方法】利用PCR得到包含编码ApoB100的3 136-3 155位氨基酸残基的目的片段,将其克隆到酵母表达载体JMB88-HA-OVA-MCS上,构建JMB88-HA-OVA-hApoB载体,用硫酸铜诱导表达后获得HA-OVA-hApoB融合蛋白。采用口服的方法对昆明小白鼠免疫成功表达HA-OVA-hApoB蛋白的酵母细胞12周,每周1次,每次1×108个酵母细胞,免疫结束后4周采血,用Western blot检测小鼠是否产生特异性抗体。【结果】PCR扩增获得了859bp的人ApoB100基因。成功构建了JMB88-HA-OVA-hApoB载体。口服免疫12周后,HA-OVA-hApoB免疫组小鼠的血清中含有特异性ApoB100抗体。【结论】灌服表达人ApoB100肽段融合蛋白的重组酿酒酵母能诱导小鼠的免疫反应,使其产生特异性抗体。     

普通烟草铁氧还蛋白I的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。     

叶片直接PCR法在玉米转基因快速检测中的应用

采用直接PCR方法跳过DNA提取步骤直接对小块玉米植株叶片进行转基因检测,并设计出针对转基因玉米叶片进行直接PCR及多重PCR的事件特异性检测体系和程序,从而极大简化了检测步骤,大大缩短了检测时长。通过对CC-2和2A-5转基因玉米及复合转基因玉米检测待测样品叶片进行直接PCR检测后发现,该直接PCR检测方法获得的PCR检测结果准确、可靠,适用于多样品玉米叶片转基因植株的快速鉴定。     

Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白在毕赤酵母中共表达及免疫效果评价

为研究Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白在毕赤酵母中共表达及其免疫原性,本研究基于酵母细胞内表达载体pPICZA,利用独立编码三个衣壳蛋白表达盒构建质粒pPICZA-vp031,重组质粒经BglⅡ线性化后进行电转化,获得重组有三个独立表达盒重组酵母菌。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明衣壳蛋白均得到正确表达且具有良好抗原性。重组酵母菌经口服免疫小鼠后,机体能够产生血清特异性IgG抗体和黏膜sIgA抗体,淋巴细胞增殖结果显示免疫小鼠淋巴细胞特异性增殖指数显著高于灭活疫苗组,细胞因子检测结果显示经特异性抗原刺激免疫小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IL-10与灭活疫苗组无显著差异,显著高于PBS对照组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。本研究为口蹄疫基因工程疫苗研制奠定基础。     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌诱导小鼠产生特异性抗体

 【目的】研究以干酪乳杆菌作为传递抗原活载体表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白的免疫特性。【方法】将构建的重组猪细小病毒（PPV）VP2基因的细胞表面表达型载体pPG-VP2电转化干酪乳杆菌L.casei 393,获得阳性重组菌pPG-VP2/L.casei 393。重组菌以2%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,经SDS-PAGE、Western blot及间接免疫荧光分析,目的蛋白获得表达。将重组菌及空质粒菌株分别口服接种Balb/c小鼠,收集粪便及肠黏液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性sIgA,采集血液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性IgG,并对获得的抗体进行PPV中和活性的测定。【结果】重组干酪乳杆菌pPG-VP2/L.casei393免疫小鼠能够产生明显的抗PPV的sIgA和IgG抗体水平,其对PPV的中和效价分别为1﹕24和1﹕128。【结论】为PPV重组乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要的物质基础。     

His6免疫原的制备及免疫小鼠抗体效价检测

采用EDC一步法将His6多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备两种人工结合抗原KLH-His6和BSA-His6。将制备的KLH-His6作为免疫原,皮下分5点注射免疫6只健康6周龄雌性Balb/c小鼠;首次免疫取KLH-His6(50μg/只)与氟氏完全佐剂(FCA)充分乳化,每只免疫200μL,以后每间隔两周,同法进行第2,3次免疫,用氟氏不完全佐剂(FIA)乳化。每次免疫8 d后尾部采血,以BSA-His6为包被抗原检测抗His6抗体。结果表明,成功制备了His6免疫原,并免疫了小鼠;间接ELISA检测不同时期小鼠抗体效价最高达到1∶8 000,免疫小鼠的抗体效价水平整体呈上升趋势,为His6单隆抗体的制备奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及特性分析

为制备猪流行性腹泻病毒(PDEV)的单克隆抗体,并鉴定单克隆抗体特性。本试验采用差速和蔗糖梯度离心纯化PEDV抗原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经ELISA方法筛选和细胞克隆,得到能分泌鼠抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出相应的单克隆抗体,并分析其特性。试验结果:获得2株能稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体,命名为E1和H6株,其中E1单隆抗体为IgG2a亚型,H6单隆抗体为IgM亚型,2株单克隆抗体均具有IFA、ELISA和Western bloting特性。E1杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别26和105,H6杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别24和104。2株单克隆抗体与Vero细胞、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均无交叉反应。Western bloting测定结果表明,E1株单克隆抗体能识别PEDV的M蛋白,H6单克隆抗体能识别PEDV的N蛋白。PEDV单克隆抗体的成功研制,为PEDV免疫诊断、表位识别及蛋白研究奠定了良好基础。     

Studies on Mucosal Immunity Induced by Transmissible Gastroenteritis Virus Nucleocapsid Protein Recombinant Lactobacillus casei in Mice and Sow

Mucosal immunity plays an important role in protecting pigs against transmissible gastroenteritis virus （TGEV） infection. To elicit mucosal immune response against TGEV, we developed a surface antigen display system using the poly-γ- glutamate synthetase A （pgsA） protein of Bacillus subtilis as an anchoring matrix to express recombinant fusion proteins of pgsA and nucleocapsid protein of TGEV in Lactobacillus casei. Surface location of fusion protein was verified by ELISA and indirect immunofluorescence test. Oral and intranasal inoculations of pregnant sow and mice with recombinant L. casei resulted in high levels of serum immunoglobulin G （IgG） and secretory immunoglobulin A （slgA） against recombinant N protein as demonstrated by ELISA. More importantly, the level of specific slgA in colostrum significantly increased compared with that of IgG. The serum IgG levels of the piglets increased after suckling colostrum produced by sows was previously inoculated with recombinant L. casei. These results indicate that immunization with recombinant L. casei expressing TGEV N protein on its surface elicited high levels of specific slgA and circulating IgG against TGEV N protein.     

小鼠鼻粘膜接种伤寒杆菌Fe-SOD的抗体应答

目的：观察小鼠鼻腔接种伤寒杆菌的Fe—SOD后血液和粘膜系统的抗体应答。方法：用IL-1作为佐剂,将伤寒杆菌的Fe—SOD经鼻腔接种小鼠,检测小鼠血液及肠液中的抗体应答。结果：当用IL-1作为佐剂时,经鼻腔接种伤寒杆菌Fe—SOD的小鼠血液和肠液中可产生高水平特异性IgG和IgA类抗体;而腹腔注射仅在血液中产生高水平特异性IgG抗体。结论：用IL-1作为佐剂,伤寒杆菌Fe—SOD经鼻腔接种后可引起小鼠粘膜系统和血液中的抗体应答。     

盐酸金霉素人工抗原的合成及鼠源多抗血清的制备

采用碳二亚胺法将金霉素(chlortetracyline,CTC)偶联到载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)和OVA(鸡卵清蛋白)上,形成免疫原BSA-CTC与包被原OVA-CTC。通过紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行抗原鉴定,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。结果表明,在UV下出现了明显特征峰,BSA-CTC的峰与BSA、CTC相比均发生改变,表明半抗原与载体成功偶联。共免疫了5只小鼠,pAb效价均达到1×10-3,其中3号小鼠多抗血清抑制效价最低,IC50(半数抑制质量浓度)为71.47ng/mL。由此得出,获得了高效价、强特异的盐酸金霉素多抗血清,为盐酸金霉素单抗的制备奠定了基础。     

一株分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞的鉴定

[目的]应用杂交瘤技术获得稳定分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]先将原核表达产物His—PoIFN一γ免疫BALB／c小鼠4次,然后进行细胞融合,再以纯化的GST—PoIFN一1作为包被抗原,用间接ELISA筛选阳性杂交瘤无性系,最终获得能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对其进行问接ELISA和Westernblot检测。[结果]试验获得l株能稳定分泌抗猪IFN一1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,被命名为B3株,经间接ELISA和Westernblot检测,该株分泌的抗体能与融合蛋白His—PoIFN一γ和GST—PoIFN一γ发生特异性反应,而与其他表达鸡γ-干扰素、His和GST蛋白等的重组质粒均不发生反应。B3株分泌的抗体小鼠腹水的ELISA效价达到1：160000,抗体亚型为IgG1型,且轻链为κ链。[结论]该研究为建立猪γ-干扰素检测方法,研究机体的免疫状态及免疫机制提供了技术基础。     

抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。