异源表达Hvsusiba2基因提高水稻胚乳淀粉含量的研究

大麦糖信号诱导转录因子(sugar signaling in barley,Hvsusiba2)作用于淀粉合成途径的上游,是大麦(Hordeum vulgare)淀粉合成途径的关键调控因子。本研究将Hvsusiba2基因构建在淀粉分支酶基因启动子pSBEⅡb下游,利用启动子的胚乳优势表达特性,驱动Hvsusiba2在胚乳中表达,增加水稻(Oryza sotiva)胚乳总淀粉含量。采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导获得转化株系。对2个单拷贝整合转基因株系相关基因转录分析显示,Hvsusiba2基因在水稻茎、叶及种子中均能正常转录。与支链淀粉合成相关基因(淀粉分支酶基因(starch branching enzyme,OssbeⅡb)、异淀粉酶基因(isoamylase,Osiso1)及蔗糖转运蛋白酶基因(sucrose transporter,Ossut1))在3个组织中的转录高于对照2倍以上;蔗糖合成酶基因(sucrose synthase,Ossus2,Ossus3)和蔗糖转运蛋白基因(Ossut5)在茎和种子中的表达显著增强(P0.05)。蔗糖合成酶基因(Ossus1)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-glucose pyrophosphorylase,Osugp1)和淀粉分支酶基因(OssbeI)在茎和叶中的表达明显增强(P0.05)。两个株系成熟种子中淀粉含量分别由77.73%提高到86.49%和85.15%。研究结果表明,水稻异源表达Hvsusiba2基因是通过提高部分淀粉合成相关基因在种子中的表达来提高种子淀粉含量的。研究结果为利用分子手段提高水稻胚乳淀粉含量提供了理论依据。     

一种快速的水稻不同组织总蛋白提取方法

介绍一种简单快捷的水稻不同组织总蛋白提取方法。该方法采用预冷甲醇和丙酮依次洗涤去除杂质和次生代谢干扰物,同时在甲醇洗涤步骤中加入蛋白酶抑制剂混合液,能够最大限度地包含所有蛋白质并降低蛋白酶的降解作用,提高蛋白质的质量和产量。采用该方法从水稻的根、茎、叶及发育中的种子中提取粗蛋白,产量为20～99mg·g-1FW,提取蛋白整个过程耗时1.6h。以SDS-PAGE胶及Western Blot检测所提总蛋白的质量,分别用核蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白以及淀粉结合型蛋白等不同类型蛋白抗体进行Western Blot检验。结果显示采用该方法所分离的总蛋白质量可以满足水稻不同类型蛋白对Western Blot的质量要求。     

水稻密码子优化的cry1Ca 基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在.对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免...     

Cre／loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

位点特异性重组系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入或删除,已成为植物遗传操作中的重要工具。本文简要介绍目前应用最为广泛的Cre/loxp位点特异性重组系统的重组机制,并着重阐述Cre/loxp系统在删除转基因植物中标记基因及定点整合等方面的应用。     

农杆菌介导法获得转可溶性淀粉合成酶基因籼稻

采用农杆菌介导法将胚乳特异性表达谷蛋白1(Glutelinl，Gtl)基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因sss导入籼稻恢复系明恢86，共获得53个独立转化再生植株。PCR检测表明，sss基因已整合进水稻的基因组中。直链淀粉含量测定结果表明，转基因植株后代直链淀粉含量较对照有较大幅度的下降。     

农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立

以籼稻恢复系明恢86为材料,探讨受体材料、愈伤代龄、预培养时间、筛选时间等因素对转化效率的影响,并建立了高效稳定的农杆菌介导籼稻转化体系.转化技术参数如下,水稻花后15 d幼胚诱导的胚性愈伤(2~6代),作为转化受体材料,经4 d预培养,农杆菌侵染30 min,共培养3 d后,在30 mg@L-1潮霉素筛选出抗性愈伤,抗性愈伤经50 mg@L-1潮霉素筛选10~15 d后立即分化,幼胚的胚性愈伤转化频率可达6.98%,并且能够周年转化.     

水稻生育期内红壤稻田氨氧化微生物数量和硝化势的变化

利用荧光定量PCR(Real-timePCR)技术,通过特异引物检测amoA基因拷贝数分析了水稻不同生育期红壤稻田土壤中氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea,AOA)的数量变化,并测定了土壤潜在硝化势。结果显示:红壤稻田土壤中AOA数量显著高于AOB,二者比例在1.6～120.7之间;红壤稻田根层土中AOA数量显著高于表土,随水稻生长根层和表土中AOA数量均逐渐增加,且根层土中增加幅度更大;在水稻生长前期表土中AOB数量较多,孕穗期后根层土中AOB数量显著增加且高于表土。水稻生长期内土壤潜在硝化势也具有逐渐增加趋势,且根层土潜在硝化势增加幅度更大。根层土中潜在硝化势与AOB和AOA数量均呈显著正相关,而表土中潜在硝化势只与AOA数量存在显著正相关。研究表明,红壤稻田土壤中AOA数量更为丰富,且与硝化作用的关联程度更为密切,证实了氨氧化微生物在红壤稻田土壤微生物组成及其生态系统功能中的重要性。     

异源表达Hvsusiba2水稻对稻田甲烷排放及土壤相关菌群的影响

Hvsusiba2是调控大麦淀粉合成和光合产物分配的转录因子。前期研究我们将Hvsusiba2导入粳稻(Oryza sativa L.subsp.japonica),Hvsusiba2粳稻稻田甲烷排放显著下降,胚乳淀粉含量显著提高。为进一步明确Hvsusiba2对稻田甲烷排放的影响,本研究我们将Hvsusiba2导入籼稻(O.sativa L.subsp.indica),研究异源表达Hvsusiba2籼稻全生育期甲烷排放和稻田主要甲烷菌及甲烷氧化菌变化。采用静态箱法测定Hvsusiba2水稻稻田甲烷排放通量,结果显示Hvsusiba2稻田全生育期的大部分时段甲烷排放量显著(P0.05)或极显著(P0.01)低于对照株系。Hvsusiba2水稻甲烷减排率幅度为54.7%~3.8%,减排率最高的时期为幼穗分化期。2个Hvsusiba2水稻株系生长季累计甲烷排放量分别为5 060.16 mg?m-2和5 250.60 mg?m-2,比对照减排30.30%和27.58%。采用荧光定量PCR法检测水稻关键生长期根土6类产甲烷菌和2类甲烷氧化菌以及土壤总细菌的丰度变化。结果显示:在整个生长期内Hvsusiba2水稻根土6类产甲烷菌菌群丰度的总体趋势是前期高、后期低;甲烷古菌(Archaea,ARC)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae,Mst)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales,MMb)3类菌群丰度的高峰出现在分蘖盛期,甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae,Msc)菌群丰度的高峰出现在幼穗分化穗期,普通产甲烷菌(Methanogens,MET)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales,MBT)分蘖期最高。Hvsusiba2水稻产甲烷菌丰度在分蘖期、抽穗期和开花期显著或极显著地低于野生型对照。在大部分测试时间段内Hvsusiba2水稻的2类甲烷氧化菌群丰度比对照有显著(P0.05)或极显著(P0.01)下降;Hvsusiba2水稻土壤总细菌丰度在水稻的分蘖期、抽穗期和开花期也显著低于野生型水稻。稻田中产甲烷菌的丰度依次是甲烷鬃菌科(Mst)甲烷古菌(ARC)普通产甲烷菌(MET)甲烷微菌目(MMb)≥甲烷八叠球菌科(Msc)甲烷杆菌目(MBT);2类甲烷氧化菌中Ⅰ型甲烷氧化菌(MBAC)丰度极显著大于Ⅱ型甲烷氧化菌(TYPEⅡ)。结合之前的研究结果,我们认为Hvsusiba2可能是通过改变水稻光合同化物分配生理,减少向土壤有机质的输送,降低土壤相关菌群的丰度达到稻田甲烷减排的。     

水稻材料IR65482抗稻瘟病基因鉴定与定位

水稻材料IR65482对不同地区的稻瘟菌小种具有广谱抗性,已知其第6号染色体上具有一个抗稻瘟病病基因Pi40(t)。本研究应用极端分离混合池重测序策略,对IR65482抗稻瘟病基因进行鉴定,并在其第11号染色体上鉴定到另一个抗稻瘟病基因。进一步利用IR65482与日本晴配置的F2群体进行基因定位,将IR65482抗稻瘟病基因定位在水稻第11染色体末端InDel标记OSL3-2和OSL3-5之间约425 kb的区间。本研究结果对利用IR65482开展水稻抗稻瘟病育种具有指导意义,也为后续克隆IR65482的抗病基因提供了理论依据。