长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的构建

为了克隆和研究具有免疫原性的长角血蜱基因,应用建库试剂盒成功构建了长角血蜱雌蜱唾液腺cD-NA表达文库.在无Rnase污染的环境下摘取半饱血长角血蜱雌蜱唾液腺,并从中提取RNA,进而纯化mRNA,利用oligo(dT)引物反转录合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并酶切,过柱分级分离后,将cD-NA分子定向连接到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体中.经体外包装转染E.coliERl647宿主菌,进行文库容量测定和扩增.以扩增文库的DNA为模板,利用载体通用引物检测cDNA文库中插入片断的大小和质量.经检测,所构建长角血蜱cDNA文库的基础库容量约为4.2×106pfu/mL,插入片段主要集中在300~2 000 bp之间,说明文库质量高、代表性强.     

长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析

蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础.     

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

 【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo（dT）引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106 PFU,扩增文库的滴度为8.2×108 PFU?ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。     

牦牛角真皮乳头cDNA文库的构建

构建cDNA表达文库用于克隆和研究牦牛角生长相关基因.Trizol提取牦牛角真皮乳头总RNA并纯化mRNA,用ZAP Express cDNA Synthesis Kit合成双链DNA,进行末端修饰,接入ZAP表达载体.经Gigapack Ⅲ Gold Packaging extract体外包装,转染XL1-Blue MRF'宿主菌,形成初级文库,初级文库进一步扩增形成稳定的cDNA文库.结果表明,文库库容量为4×107,重组率达93%,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效工具.     

牛促卵泡激素基因克隆筛选和序列分析

从牛垂体中分离出总mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,经T4DNA聚合酶切成平末端后与Sma I酶切的pUC19连接,转化JM83,构建了脑垂体mRNA的cDNA文库.用标记的牛促卵泡激素基因的寡核苷酸片段进行杂交,从文库中筛选到几个阳性克隆,其中一个含有全长的牛促卵泡激素基因编码序列.利用PCR扩增技术从cDNA中扩增出了387bp的牛促卵泡激素基因,序列分析表明,10号克隆中的牛促卵泡激素基因含有起始密码ATG及终止密码TAA,所编码的氨基酸序列与天然牛促卵泡激寡素的氨基酸序列相同.     

利用SMART技术构建海带配子体cDNA文库

用Trizol试剂提取海带配子体总RNA,用SMART cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.1×108Pfu/ml,文库有500μl体积,库容量为5.5×107Pfu,通过PCR检测,文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.8~1.8 kb,平均插入片段长度约为1.34 kb。这些数据表明,已获得高质量的海带cDNA文库,为海带基因资源保存及新基因的克隆奠定了基础。     

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

利用烟草的cDNA酵母表达文库筛选镉胁迫相关基因

为了鉴定烟草在重金属镉胁迫处理下的功能基因,构建烟草cDNA酵母表达文库,并利用镉敏感的突变株对文库进行初步筛选。首先将烟草幼苗进行重金属胁迫处理,然后取幼根提取总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成双链cDNA,将cDNA与入门载体pDONR222的同源重组区连接,再转到酵母表达载体pDEST22上,构建了Gateway技术兼容的酵母cDNA表达文库。经检测,构建的cDNA酵母表达文库滴度为4.32×106 cfu/mL,库容量为0.86×107 cfu,平均插入片段长度大于1kb,文库质量较高。通过镉敏感酵母突变株Δycf1筛选烟草重金属镉胁迫相关基因,获得酵母单克隆70个。经分析可知,其涉及到谷胱甘肽转移酶、铜分子伴侣及甲硫蛋白等24个不同蛋白基因,初步鉴定为烟草应答重金属镉胁迫的候选基因。     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌(A.tenuissima)cDNA酵母表达文库.经检测,文库的平均滴度为2.44×106 cfu/ml,文库总容量为2.44×107 cfu(colony-forming unit),阳性克隆率为100%,平均插入片段约为1.38 kb.细极链格孢菌cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础.     

亚洲棉（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定

 【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库,建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台,发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官,提取总RNA并分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN（duplex-specific nuclease）法对全长双链cDNA进行均一化,均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体,包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1,库容2×106个独立克隆,重组率大于95%,插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST（expressed sequence tags）测序,冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示：78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好,质量符合要求,可能包含大量新基因,是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。     

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。     

蜡梅花cDNA文库构建及其高频出现脂转移蛋白cDNA的表达

【目的】构建蜡梅花cDNA文库，分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达，为探索蜡梅冬季开花分子机理，分离克隆特色基因奠定基础。【方法】以蜡梅花器官为材料，用SMART cDNA Library Construction Kit 构建文库，RT-PCR分析基因表达。【结果】经测定原始文库滴度达到1.4×106 pfu/ml，扩增总文库滴度约为1010pfu/ml，重组率达到96%，插入片段在0.5 kb 以上，平均约1.1 kb，通过PCR 检测，从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强，LTP基因具有内含子，而总文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染， LTP基因在蜡梅开花各个时期均表现较高的转录水平，与EST分析时高频率出现LTP序列的情况相符，证实所构建的文库能够反映蜡梅开花过程基因表达的基本情况。【结论】已获得高质量的蜡梅花cDNA文库，可以用于进一步的基因克隆或EST测序分析，这是首次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。LTP基因在蜡梅开花过程中可能具有重要的生物学功能，为探索蜡梅冬季开花分子机理提供了线索。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种PL基因真核表达载体的构建与表达

【目的】构建香蕉枯萎病菌1号小种（FOC1）和4号小种（FOC4）果胶裂解酶（Pectate lyases, PL）基因的真核表达载体,并进行诱导表达,为进一步研究PL在病原菌致病过程中的作用奠定基础。【方法】将质粒pMD18-pl-foc1、pMD18-pl-foc4和真核表达穿梭载体pPICZαA进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应,回收目的片段连接,转化至DH5α进行筛选扩繁,对菌落进行PCR鉴定后抽提质粒进行PCR和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。将阳性载体线性化后电击转化毕赤酵母 SMD1168感受态细胞,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。【结果】成功构建了FOC1和FOC4 PL基因的真核表达载体pPICZαA-pl-foc1和pPICZαA-pl-foc4,经甲醇诱导表达后分别获得了重组的PL蛋白,其分子质量约为23.4 ku。【结论】FOC1和FOC4 2个香蕉枯萎病菌小种的PL基因在酵母中得到了成功表达。     

PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库的构建及鉴定

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头,再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNAT7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL,扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95．83％,且插入片段主要分布于500-2000bp,其中500～750bp的占21．73％,750～100bp的占21．73％,1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。