基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%.     

病毒载体研究进展

外源基因进入细胞通常需要“运载工具”。在漫长的自然进化过程中,病毒是以寄生形式存活下来的最小、最简单的生命体,病毒分子生物学的发展为生物工程领域研究拓展了思路,提供了有效的方法和工具。重组病毒栽体又是当今病毒基因工程研究的热点之一,目前以动物病毒为基础设计的基因克隆及表达栽体主要有取代型的重组病毒栽体和重组的病毒一质粒栽体。文章对应用较广泛的病毒栽体做一综述。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。     

长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析

蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础.     

长角血蜱卵cDNA表达文库的构建

 【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo（dT）引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106 PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109 PFU•ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

猪瘟的流行病学特点、诊断与控制措施

猪瘟是一种猪的高度接触传染的病毒性疾病,严重威胁养猪事业的发展,是我国猪的四大疫病之一.我国目前猪瘟发生的原因很多,造成了巨大的经济损失.本文针对我国的疫病现状,参照欧洲等发达国家的控制措施,对猪瘟的流行病学特点、诊断及控制措施等方面做一较为全面系统的介绍,为有效控制猪瘟,研究改进猪瘟疫苗和认真制定执行控制和消灭猪瘟的长期规划提供资料.     

长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达

根据GenBank中的长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制荆(Haemaphysalislongicornis serine proteinase inhibitor-2,HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1164 bp的HLS2DNA片段.将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E.coli BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析.优化表达条件后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性.结果表明,获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2(序列号AB162827)序列的同源性为98%.构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了约为47 000的HLS2融合蛋白,主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7 h后融合蛋白的表达量最高.Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应.     

结核分枝杆菌的分子生物学特点

结核分枝杆菌是分枝杆菌属中最重要的一种细菌,是肺结核的病原。肺结核是世界上常见的传染病之一,每年约导致二百多万人死亡和八百多万人致病,给人民生活和国家的经济建设带来了巨大损失。搞清该病原的分子生物学特点对于该病的控制及治疗都有十分重要的意义。本文对结核分枝杆菌的分类、表型特征、基因组及质粒、毒力因子、致病机制、主要保护性抗原、免疫防制等生物学特点进行论述,以对该致病因子有一个较为全面的认识,从而达到更好预防和治疗结核病的目标。