基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%.     

马梨形虫病诊断技术研究现状

近年来马梨形虫病流行呈上升趋势,对马属动物产业的发展造成了极大的危害.因此,建立一种实时有效的检测方法就显得尤为重要.病原学诊断法、免疫学诊断法、分子生物学诊断方法的相继建立,为马梨形虫病的早期诊断提供了必要的手段.近年来单克隆抗体技术,DNA重组技术的应用,为该病的诊断提供了新的方法.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡Ⅱ型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡Ⅱ型干扰素（ChIFNγ）基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插人到鸡痘病毒转移载体中，构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY—ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），经过8轮蓝斑筛选，得到纯化的能够同时表达鸡Ⅱ型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV—ChIFNγS1。rFPV—ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后，可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体，重组病毒接种鸡的CD4^＋、CD8^＋和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡（P％0．05）；免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击，rFPV—ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状（1／16），而非免疫对照组则有16只发病（16／16），并有2只出现死亡（2／16），表明rFPV—ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。     

不同饲喂方式和温度对长角血蜱甘肃株生物学特性的影响

在不同饲喂方式和温度条件下,观察我国北方长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)甘肃株的生活史及对其生物学特性的影响。将试验蜱分组后置于不同饲喂方式和温度下,待其发育到下一阶段,叮咬实验动物,连续调查其发育阶段的生物学特性。研究发现,完成一个世代需101 d～148 d。成年饥饿雌蜱吸血期具有两个显著特征:缓慢吸血和快速吸血;经兔体叮咬的成年雌蜱其饱血体重小于羊体。不同饲喂条件下长角血蜱饱血体重、产卵量差异极显著(P0.01);在一定温度范围内,幼蜱、若蜱的蜕变时间随温度的升高而缩短;当饱血雌蜱处于发育阶段时,产卵前期、产卵期及卵的孵化期均随着温度的升高而缩短;16℃～30℃条件下长角血蜱产卵量没有变化,利于蜱的存活;4℃以下和45℃以上饱血蜱及其后代不能存活;16℃以下蜱的发育周期延长。结果表明,长角血蜱为三宿主蜱;雄蜱可以帮助雌蜱吸血;在羊体上的吸血能力优于在兔体上的吸血能力;温度对长角血蜱的发育繁殖有影响。     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫(Theileria annulata)可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞(即非转化宿主细胞)为试验材料,提取总RNA和m RNA,反转录合成c DNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交(SSH),构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签(ESTs)364条,大小主要分布在350—1 200 bp之间;将这些ESTs序列在Gen Bank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条(其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列)和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

18S rRNA序列差异在马梨形虫分类学中的应用

为揭示18S rRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026) 18S rRNA基因序列,在其V4高变区设计引物.将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序,正确的结果与其他种梨形虫的相应序列进行分析.系统发生树结果显示,泰勒虫和巴贝斯虫处于明显的两个分支,而称之为马巴贝斯虫的物种和泰勒虫有着较为密切的关系,他们处于同一分支,其亲缘关系较巴贝斯虫更远.序列对齐分析表明,巴贝斯虫核苷酸序列相对于泰勒虫种序列存在多个位点的缺失和突变.而马巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA V4高变区核苷酸序列的相似程度较高,与巴贝斯虫在该序列上的差异较大.以上结果表明,泰勒虫种和巴贝斯虫种18S rRNA V4高变区核苷酸序列间的这种缺失和突变可作为泰勒虫和巴贝斯虫分类依据的本质因素之一.马巴贝斯虫应隶属于泰勒虫科,泰勒虫属.     

长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析

蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础.     

长角血蜱卵cDNA表达文库的构建

 【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库，为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA，进而纯化mRNA，采取oligo（dT）引物合成双链cDNA，定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体，转染大肠杆菌ER1647，测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106 PFU，重组率为100%，扩增后文库的滴度为2×109 PFU•ml-1。获得了目的基因，其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。     

环形泰勒虫spm-N蛋白的原核表达及鉴定

子孢子与裂殖体2(spm2)是环形泰勒虫重要的表面抗原。为了深入研究环形泰勒虫spm2主要抗原区域spm-N蛋白的功能,利用大肠杆菌表达系统表达重组spm-N蛋白并进行纯化及鉴定。通过序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增环形泰勒虫spm-N基因片段,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。结果显示:重组spm-N蛋白以可溶性的形式表达,获得了较高纯度的spm-N蛋白,且该蛋白的反应原性和特异性均较好。本研究成功表达了重组spm-N蛋白,为深入揭示spm-N蛋白的功能提供了依据。     

蜱源蛋白酶及其应用前景

蜱源蛋白酶在蜱和蜱传播疾病的致病机制中发挥重要的生理功能,但对于定性的寄生原虫蛋白鬃酶来说了解得还不很透彻,为了进一步研究蜱源蛋白酶的功能及其特征,筛选出更有价值的蛋白酶基因作为抗蜱疫苗候选抗原基因,从已有的蜱源蛋白酶生理作用角度介绍了蜱源蛋白酶的重要性,提出了将来研究蜱蛋白酶要攻克的难点,为我国采用分子文库的方法筛选抗蜱疫苗候选抗原及研制化学药物提供资料.