橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库构建及IGF2基因克隆与结构分析

 【目的】从功能基因组学角度深入研究鹿茸软骨组织生长发育机理,探讨胰岛素样生长因子-II（IGF2）在鹿茸软骨组织生长发育过程中的作用。【方法】利用SMART技术构建了东北马鹿鹿茸软骨组织全长cDNA文库,并设计IGF2基因保守引物对该文库进行筛选。【结果】构建的未扩增文库滴度为1.8×106 pfu•ml-1,文库重组率大于89.8%;插入片段平均长度约为1.2 kb;扩增文库滴度为1.4×1010 pfu•ml-1;克隆东北马鹿IGF2基因（GenBank登录号：EF177491）CDS区为540 bp,编码179 aa长度的多肽,与GenBank中检索得到的猪、马、牛、羊、人、小鼠和大鼠IGF2基因进行比对分析显示,马鹿IGF2多肽无色氨酸（Trp）,组氨酸（His）与苏氨酸（Thr）含量在8个物种中最高;重建系统树结果显示,东北马鹿IGF2与牛和羊IGF2基因具有最高的相似性。【结论】成功构建东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库并克隆到IGF2基因。     

黄牛肉中钙激活酶系统的动力学性质#br#

 【目的】阐明牛肉中钙激活酶系统的主要动力学特征。【方法】通过温度、时间、Ca2+浓度、反应时间、酶量、底物浓度等的变化,分析µ-钙激活酶,m-钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白的动力学特性。【结果】随冷冻温度的升高和贮存时间的延长,钙激活酶系统活性都逐步降低,但冷冻处理可以显著降低钙激活酶抑制蛋白的活性,而钙激活酶对冷冻处理不太敏感;µ-钙激活酶达到最大活性一半时所需的Ca2+浓度为50 µmol•L-1,m-钙激活酶为320 µmol•L-1;在测定钙激活酶活性时,反应时间应控制在60 min以内,酶活单位应小于0.45;在以酪蛋白为底物时,m-钙激活酶的Km值为3.185 mg•mL-1,Vmax为0.015 U•min-1,而µ-钙激活酶的Km值为5.320 mg•mL-1,Vmax为0.017 U•min-1。【结论】钙激活酶系统活性受贮藏温度和时间、Ca2+浓度、酶促反应时间、酶量、底物浓度影响明显。     

不同致病力Rhizoctonia菌株对玉米木质素代谢、总酚含量及相关基因表达的影响

【目的】通过分析不同致病力Rhizoctoniaspp.菌株与玉米互作过程中寄主PAL活性、木质素和总酚含量及PAL、POD、PR-1基因的诱导表达特点,了解玉米对Rhizoctoniaspp.侵染的抗性反应.【方法】采用分光度计法和定量RT-PCR法,分别测定不同菌株接种后玉米叶鞘苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、木质素含量和总酚含量变化及PAL、POD、PR-1基因的表达动态.【结果】玉米对不同致病力的Rhizoctonia solani AG1-IA菌株的反应有明显差异,菌株致病力越强,玉米PAL活性、木质素和总酚含量越高;同一菌株处理的玉米,其木质素含量变化与PAL活性变化呈正相关;强致病力菌株LY1-3-1接种后的48h和96h,PAL和PR-1基因表达量分别达最高;弱致病力菌株NJ002-12和YZ006-14接种96h后,PAL和PR-1基因表达量分别达最大水平;POD在不同处理中的表达趋势与PAL和PR-1类似.【结论】3个Rhizoctonia solani AG1-IA菌株都可增强玉米防御酶活性及基因的表达,并且抗性反应与菌株的致病力成正相关;弱致病力的双核丝核菌BX006-1对玉米的防御酶及相关卫基因的表达无明显影响.     

泰妙菌素混悬注射液在猪体内的药物动力学及生物利用度研究

 【目的】 研究并比较泰妙菌素混悬注射液和泰妙菌素注射液在猪体内的药物代谢动力学特征及生物利用度。【方法】 7头健康猪,按随机拉丁方设计,进行单次给药剂量(10 mg•kg-1 b.w)静注、肌注泰妙菌素注射液和肌注泰妙菌素注射混悬液,高效液相色谱串联质谱法测定猪血浆中泰妙菌素的浓度,罗红霉素作为内标,3P97药动学计算软件处理血浆药物浓度－时间数据。【结果】 猪静注给药的药时数据符合无吸收三室开放模型,主要药动学参数为：t1/2β为2.04±0.23 h,t1/2α为0.39±0.06 h,t1/2π为0.12±0.04 h,Vd 为8.73±1.83 L•kg-1,AUC为3.78±0.52μg•mL-1•h-1,ClB为2.99±0.43 L•kg-1•h-1)。猪肌注泰妙菌素注射液的药时数据符合一级吸收二室开放模型,主要的药物动力学参数分别为：t1/2Ka(0.06±0.01)h,t1/2β(3.67±0.41)h,Tmax(0.18±0.03)h,Cmax(1.32±0.25)μg•mL-1,AUC(2.62±0.21)μg•mL-1•h-1,生物利用度为73.51%。猪肌注泰妙菌素混悬液的药时数据则符合一级吸收一室开放模型,主要的药物动力学参数为：t1/2Ka(0.04±0.01)h,t1/2Ke(2.90±0.43)h,Tmax(0.27±0.03)h,Cmax(0.7±0.11)μg•mL-1,AUC(2.80±0.35)μg•mL-1•h-1,生物利用度为75.73%。t检验比较肌注泰妙菌素注射液和泰妙菌素注射混悬液的主要药动学参数,结果表明,两者除达峰浓度Cmax有显著差异外,AUC、t1/2Ka、Tmax、t1/2Ke和生物利用度均无显著性差异。【结论】泰妙菌素注射混悬液肌注后在猪体内具有吸收迅速,体内分布广,达峰迅速,消除较快的药动学特征。     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×10⁷,初级文库的滴度为3.56×10⁶ cfu·mL^-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

阿莫西林在猪血清和组织液中对金黄色葡萄球菌的半体内药动-药效同步模型的研究#br#

 【目的】为合理应用阿莫西林治疗猪金黄色葡萄球菌感染。【方法】采用了体内药动和体外药效联合的方法研究了阿莫西林在血清和组织笼液中抗金黄色葡萄球菌的活性。【结果】体外测定,阿莫西林在血清和组织笼液中对猪金黄色葡萄球菌的MIC均在0.2 µg•mL-1＜MIC＜0.4 µg•mL-1的范围之内。如果在血清和组织液中添加更多的细菌,则需要高于MIC药物浓度才能能持续抑制细菌的生长。猪按10 mg•kg-1的剂量肌内注射阿莫西林后,在血清中,半效浓度（EC50）为143.63±54.35,即血清药物浓度为2.39 μg•mL-1时可产生50%最大效应。在组织液中,半效浓度（EC50）为29.61±5.07,即组织液药物浓度为0.49 μg•mL-1时可产生50%最大效应。【结论】临床上选择阿莫西林治疗猪金黄色葡萄球菌感染时,用药的剂量和间隔应根据实际情况确定,当治疗猪金黄色葡萄球菌轻度感染时,建议给药方案可设定为10 mg•kg-1体重的剂量进行颈部肌内注射,给药间隔为2次/日。当治疗重度感染时由于体内MIC的升高,体内药物维持抗菌时间减少,必须增加给药次数,可设为3次/日,必要时可增加为4次/日。     

牛源金黄色葡萄球菌突变株的筛选、鉴定及其免疫原性的研究

 【目的】诱变牛源金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb),筛选、鉴定弱毒性突变株,并研究其在鼠上的免疫交叉保护性。【方法】牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb,经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)化学诱变,经生长特性、回复突变、毒力检测、LD50、多种特征性酶检测、小鼠中免疫保护性等实验比较研究了突变株与亲本株的生物学特性,筛选得到遗传性状稳定β－溶血素缺失的弱毒性突变株。【结果】弱毒性突变株Hx与亲本株相比：其β－溶血性状完全缺失,生长缓慢,耐热核酸酶、血浆凝固酶等胞外蛋白的产量减少,在活体条件下可产生荚膜,半数致死量(LD50)10－1.83•mL-1远低下于亲本株的10－4.33•mL-1。亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死量是未接种过的6—50倍。非亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死率是未接种过的5—60倍。【结论】突变株Hx的β－溶血素缺失,毒性减弱,对金黄色葡萄球菌攻击具有较高免疫保护性。     

体外法研究不同油脂对瘤胃原虫吞噬细菌微循环的影响

【目的】研究体外培养条件下,不同油脂对瘤胃原虫吞噬细菌微循环及微生物群体的影响。【方法】3头瘤胃瘘管山羊提供瘤胃液,分别以菜籽油(A)、豆油(B)、玉米油(C)和花生油(D)为底物培养瘤胃微生物,同时设空白对照组,培养10h时用荧光标记瘤胃细菌法进行原虫吞噬细菌试验。【结果】原虫密度以对照组最高,显著高于A、B、C组(P0.05);细菌密度以B组最高,为4.906×109cells·mL-1,显著高于对照组(P0.05);原虫蛋白在组间差异不显著(P0.05),细菌蛋白组以B组最高,B、C、D均高于对照组(P0.05)。各组原虫的吞噬速率分别为:267.6(对照组)、196.2(A组)、244.4(B组)、274.4(C组)、285.4(D组)cells/(cell·h),组间差异显著(P0.05)。吞噬细菌N的速率分别为1.445、1.059、0.320、1.482、1.541pgN·(cell·h)-1。【结论】估算每天每头山羊细菌蛋白循环量分别为121.64(对照组)、56.64(A组)、78.39(B组)、87.04(C组)和95.06(D组)mg蛋白·(d·头)-1,B组较低,仅为对照组的64.45%,且该组微生物量最大。在本试验的基础上认为4%的豆油对微循环的调控效应最好。     

一株玉米肠致腐菌的16S rDNA鉴定及其防腐剂复配优化

 【目的】从发黏、黏稠汁液渗出败坏的玉米肠中分离获得1株导致产品腐败的菌株ym11,为构建控制技术,提高玉米肠安全水平,对该菌进行鉴定和防腐剂优化。【方法】采用16S rDNA序列分析对该菌进行鉴定,并通过MIC测定其对不同防腐剂的敏感性,利用响应曲面法对防腐剂复配进行优化。【结果】该菌属枯草芽孢杆菌属,同源性相似度达97%。对乳酸链球菌素、聚赖氨酸、尼泊金乙酯较敏感,MIC分别为39、39和125 mg•L-1。响应曲面优化结果显示,当乳酸链球菌素、聚赖氨酸、尼泊金乙酯浓度分别为11.30、10.90和4.80 mg•L-1时,可使基质中的ym11降低2个数量级。【结论】该菌属于枯草芽孢杆菌属,利用复合防腐剂可有效对其杀灭。     

电针复合静松灵麻醉对山羊痛阈及生理生化的影响

 【目的】了解电针复合静松灵麻醉对山羊麻醉痛阈值及生理生化指标的影响。【方法】30只成年杂交山羊,体重22—27 kg,随机分为0.5 mg•kg-1静松灵组、2 mg•kg-1静松灵组、电针复合0.5 mg•kg-1静松灵组、电针组和空白对照组,每组6只,公母各半。分别在给药后0、5、25、45、65和85 min（单纯药物组）,或电针后0、25、45、65、85、105 min（电针组或电针复合药物组）采用钾离子透入法测定痛阈值,并测定呼吸频率、心率、平均股动脉压、体温等生理指标,于试验前及试验后1.5、24、48、96和168 h,采集山羊血液分别测定丙氨酸氨基转移酶活性、天门冬氨酸氨基转移酶活性、血清尿素含量、血糖含量、皮质醇含量等指标。【结果】电针复合0.5 mg•kg-1静松灵组山羊的痛阈在给药后显著高于单纯电针组和0.5 mg•kg-1静松灵组（P＜0.05）,而与2 mg•kg-1静松灵组无显著性差异（P＞0.05）;电针复合0.5 mg•kg-1静松灵组山羊的呼吸频率、平均股动脉压、天门冬氨酸氨基转移酶活性以及血清葡萄糖、尿素和皮质醇含量与对照组无显著差异（P＞0.05）,而0.5 mg•kg-1静松灵组与2 mg•kg-1静松灵组山羊天门冬氨酸氨基转移酶活性及血清葡萄糖、尿素或皮质醇含量与对照组差异显著（P＜0.05）;电针复合0.5 mg•kg-1静松灵对山羊的心率、体温和丙氨酸氨基转移酶活性的影响显著低于0.5 mg•kg-1或2 mg•kg-1静松灵（P＜0.05）。【结论】山羊电针复合静松灵麻醉痛阈值高,麻醉效果较好,生理生化指标干扰小。     

架式与新梢留量对赤霞珠葡萄酒中单体酚的影响

【目的】研究架式与新梢留量对葡萄酒中单体酚的影响。【方法】以赤霞珠为试材,采用HPLC分析法,研究不同新梢留量、单篱架与“V”形架栽培条件下所酿干红葡萄酒中单体酚的种类及含量。新梢处理设3个水平,分别为每延长1 m架面留新梢10、13和16个。【结果】(1)单体酚总量随单位新梢留量的降低而增加(119.08—146.40 mg•L-1),且各处理间存在极显著差异;“V”形架栽培下的葡萄酒单体酚总量(133.47 mg•L-1)高于单篱架(119.08 mg•L-1)。(2)各处理条件下葡萄酒中非类黄酮含量(100.13—123.46 mg•L-1)均高于类黄酮含量(17.08—25.25 mg•L-1),前者占单体酚总量的81.08%—85.66%,后者占14.34%—18.92%。(3)各处理条件下均可检出待测10种单体酚,类黄酮类物质以儿茶素为主,非类黄酮类物质以没食子酸为主。【结论】降低赤霞珠葡萄单位面积留梢量可提高葡萄酒中单体酚的含量;“V”形架栽培可提高葡萄酒中单体酚的含量。     

P. syringae pv. glycinea M-18生产冠菌素补料发酵工艺优化研究

【目的】提高丁香假单胞菌大豆致病变种高产突变株P. syringae pv. glycinea M-18,发酵生产冠菌素的产量。【方法】研究补料分批发酵过程中初始葡萄糖浓度、葡萄糖补加浓度、补加时间、补加次数、补加三氯化铁的浓度及pH对发酵产生的影响,并在5 L发酵罐中进行放大试验。【结果】在5 L发酵罐中,自发酵后84 h起,保持葡萄糖浓度在5—2 g.L-1,初始葡萄糖浓度为10 g.L-1,发酵后84 h每升发酵液补加0.005 mmol三氯化铁,发酵过程中用40 g.L-1的MgCO3来调控pH在6.7左右,与对照相比冠菌素的产量显著提高,最高达31%。【结论】在发酵过程中将葡萄糖控制在一个较合适的范围内可以显著提高P. syringae pv. glycinea M-18发酵生产冠菌素的产量。     

影响降解菌Y1降解土壤中异噁草酮的三种因素的优化#br#

 【目的】研究田间持水量、接种量以及肥料添加量对降解菌Y1降解土壤中异噁草酮的影响,优化异噁草酮降解菌Y1的降解条件。【方法】利用生物测定的方法,通过二次回归旋转组合设计确定最优降解条件。【结果】得到降解条件的优化数学回归模型为y=65.05812+9.60065*C1+10.49792*C2+3.60229*C3-6.88851*C12-4.41187*C22。各因素对降解率的影响大小顺序依次为接种量、田间持水量、肥料添加量。【结论】当接种量(13.46—15.48 mL•kg-1),田间持水量(56.93%—62.0%),肥料添加量(1.82—2.18 g•kg-1)分别在所示范围内时,降解菌在异噁草酮有效成分浓度为500 µg•kg-1的风干土壤中,30 d后的降解率可达到60%以上。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

长期施用含硫含氯化肥稻田土壤化学性质的演变特征

【目的】探讨长期施用含硫和含氯化肥土壤化学性质的演变,为稻田土壤的合理施肥及持续利用提供理论依据。【方法】对持续33年施用含硫和含氯化肥的定位试验历年土壤样品化学性质进行系统测定,统计分析其变化特征。【结果】长期施用SO42-、Cl-+SO42-和Cl-肥料的土壤pH均表现下降趋势,施用SO42-肥料的土壤pH随年份极显著下降,年均下降0.028个pH单位。各处理(SO42-、Cl-+SO42-和Cl-处理)土壤有机质、全氮、全磷及Olsen-P含量都有增加趋势,SO42-、Cl-+SO42-和Cl-处理土壤有机质年均增加分别为0.31、0.17、0.15 g.kg-1,全氮年均增加分别为10.6、3.0、11.2 mg.kg-1,全磷年均增加分别为22.9、21.0、4.8 mg.kg-1,Olsen-P年均增加分别为1.42、1.14、0.58 mg.kg-1。各处理土壤全钾和交换性钾含量基本保持平衡,无明显增加或下降趋势。【结论】长期施用含硫化肥有利于土壤有机质和全磷积累,以及土壤有效磷活化。因此在南方红壤丘陵地区,应重视含硫肥料的施用并注意防止其酸化。     

中国主要生态区小麦施肥增产效应分析

【目的】分析中国主要农业生态区小麦的化肥增产效应,为小麦进一步增产和提高化肥效率提供依据。【方法】总结近年来全国测土配方施肥试验示范数据,通过化肥偏生产力、农学效率等指标分析中国主要农业生态区小麦施肥的增产效应及其变化特点。【结果】各区域施肥量水平较高且差异明显,其中黄淮海区施肥量最高,为383 kg.hm-2;北部高原区施肥量最低,为233 kg.hm-2。西北区和长江中下游区的化肥增产作用高于北部高原区和黄淮海区。化肥偏生产力水平最高的区域是西北区,为23.9 kg.kg-1;最低的地区是黄淮海区,为17.4 kg.kg-1。化肥农学效率的最高的地区是西北区,为9.7 kg.kg-1;最低的地区是黄淮海区,为4.2 kg.kg-1。与20世纪80年代初相比,长江中下游区和西北区的氮肥农学效率分别提高了21.6%和5.6%,而黄淮海区和北部高原区分别降低了46.0%和12.4%;北部高原区和西北区的磷肥农学效率分别提高了13.7%和10.4%;黄淮海区和长江中下游区分别降低了38.6%和6.24%。【结论】各区域小麦施肥水平明显提高且差异加大,化肥增产作用仍很显著,增产效应差异明显,粮食低产区不一定是化肥高效区。合理施肥,提高化肥养分效率仍然是各区域小麦增产的重要途径。     

紫山药酚酸类化合物鉴定及含量测定

【目的】对产自浙江省台州市黄岩区的紫山药中的酚酸类化合物进行鉴定和含量分析,为其后续天然产物研究提供参考,有利于紫山药及其加工产品的宣传,为这种特色蔬菜更好地走向市场提供帮助。【方法】采用高压液相色谱-二极管阵列技术,对该特种紫山药中的酚酸类化合物进行鉴定,并对其含量进行测定。【结果】酚酸在紫山药中主要以可溶态酚酸形式存在。紫山药中可溶态酚酸类和不可溶态酚酸类均主要为芥子酸和阿魏酸,且芥子酸含量均高于阿魏酸含量。紫山药中可溶态酚酸含量为356.71μg.g-1DW;不溶态酚酸含量为26.92μg.g-1DW。【结论】高压液相色谱-二极管阵列-质谱技术可快速有效分析紫山药中的酚酸类化合物。